生物大分子实验报告

1、高级生物化学与分子生物学综合实验报告1、 实验目的以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线，进行基因操作、蛋白质表达、亲和层析纯化等的训练，通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展研究生课题研究奠定实验基础。2、 实验原理利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA 在体外进行重组，然后把这种重组DNA 转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋白。为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。3、 实验内容一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化实验1.重组质粒的分离、纯化及检测实验2.质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收实验3.

2、感受态细胞的制备、连接与转化二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达实验4.细菌的大量培养及重组蛋白的诱导三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定实验5.细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化实验 6. 目标蛋白的SDS-PAGE 鉴定实验 1 质粒 DNA 的分离、纯化及检测材料、设备及试剂一、材料转化的细菌，1.5ml 塑料离心管,离心管架。二、设备微量取液器(20间200 01000m)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂1. LB液体培养基(Luria-Bertani):称取蛋白陈(Tryptone)5 g,酵母提取物 (

3、Yeast extract) 2.5g ， NaCl 5g ，溶于 800ml 去离子水中，用NaOH 调 pH 至1.5, 加去离子水至总体积500 mL ，高压下蒸气灭菌20 分钟。2. LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉，高压灭菌。3. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp) 母液：配成50mg/ml 水溶液 , -20 保存备。4. 质粒提取试剂盒。操作步骤1. 细菌的培养和收集将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5ml LB 液体培养基(含50闻/ml Amp)中，37 c振荡培养约12小时至对数生长后期。2. 取液体培养物1.2 mL 于 E

4、ppendorf 管中，然后6000 g/min 离心 2 min ，弃上清。3. 质粒的提取，参照质粒提取试剂盒说明。4. -20 保存 DNA 以备电泳检测。实验 2 质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收材料、设备及试剂一、 材料质粒；Hindm酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose)设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。试剂50 XTAE电泳缓冲液;6 x电泳载样缓冲液。操作步骤DNA 酶切反应1. 反应体系组成：10X BufferHindIIIPlasmid20山H2O24 L浴保温 1 小时，使酶切反应完全。3. 停止反应，

5、置于冰箱中保存备用。琼脂糖凝胶电泳用。2. 混匀反应体系后，1.取50 XTAE缓冲液4ml加水至将 eppendorf 管置于泡沫板上，37水200ml ,配制成1 XTAE稀释缓冲液，待2. 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 1 XTAE稀释缓冲液，轻轻摇匀，溶胀30min ，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化。3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽放好，插上样品梳子。将冷却至50-60 的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。4. 加样：取10酶解液与26 X载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。5. 电泳： 加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电

6、源。控制电压保持在60-80V ，电流在 40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。6. 染色观察和拍照。7. 回收条带，用回收试剂盒。步骤参见试剂盒说明书。实验 3 感受态细胞的制备、连接与转化材料、设备及试剂一、材料E. coli BL21/DE3 菌株 : Amp -；无菌 eppendorf 管。二、 试剂LB 液体培养基、T4 DNA 连接酶、氨苄青霉素、含Amp 的 LB 固体培养基操作步骤1、 连接反应1. 取新的经灭菌处理的1.5ml eppendorf 管 , 编号。2. 体系组成：共10NBuffer1X回收的 DNA 片段100 ngT4 DNA

7、 ligase去离子水3. 顺序： 去离子水、回收的 DNA 片段、 回收的 DNA 片段、 T4 DNA ligase 。4. 混匀后用小离心机将液体全部甩到管底,于 16保温8-24h 。2、 E. coli 感受态细胞转化1 .从4c冰箱中取200川感受态细胞悬液，立即置冰上。2 .加入连接产物溶液(体积不超过10时，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。3 . 42 水浴中热击90 秒 ,热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。4 . 向管中加入0.8ml LB 液体培养基(不含Amp) ，混匀后37 低转速振荡培养 45min ，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5 .将上述

8、菌液摇匀后取200涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置 5-10min ，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37 培养16-24 小时。同时做两个对照: 对照组 1: (-) 感受态细胞，此组正常情况下应不产生菌落。对照组2: (+) 1川质粒，此组正常情况下应产生大量。实验四细菌的大量培养及外源蛋白的诱导操作步骤种子培养液的准备和外源蛋白的诱导表达1. 取冻存的菌种，接种入装有5-10ml LB 培养基的瓶中，37，200rpm/min过夜培养后接入100ml LB 培养基，接种浓度为2%。2. 37 ， 200rpm/min 培养 3 小时后， 将摇床温度调节到诱导温度20并平衡 3

9、0min ，然后加入IPTG 至终浓度0.4mM ，继续培养过夜。实验五细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化材料及试剂一、材料经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌、Ni-NTA 介质（ Ni 亲和介质）二、试剂1缓冲液: 20mmol/L Tris-HCl ， pH8.0 ；2缓冲液配制10mM 、 50 mM 、 100 mM 、 250 mM 咪唑。操作步骤一（细菌破碎）1. 将菌液转入大离心瓶中，离心收菌，4000rpm ， 10min ；2. 倒掉上清，将菌体悬于10mL 缓冲液中，超声破碎细菌；3. 将破菌产物离心，12000rpm ， 15 min ；4. 分别对上清和沉淀留样，通过 SDS

10、聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达情况和蛋白操作步骤二（目标蛋白纯化）1. 处理介质：向柱中加入0.5mL NiTA 介质后， 用 5 倍柱体积的去离子水洗涤介质； 再用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤介质；以下步骤根据蛋白性质在16 下进行操作；2. 加入蛋白样品：加入超声破菌后的蛋白上清样品；3. 洗涤杂蛋白：用5 倍柱体积的10mM 咪唑洗涤介质；4. 洗涤目标蛋白：用50 mM 、 100 mM 、 250 mM 不同浓度的咪唑各2.5ml ，梯度洗脱介质，回收流出液，保存于4，用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。实验六 目标蛋白的SDS-PAGE 鉴定-可编辑修改-10 %十二烷基硫酸钠（SDS

11、）贮存液、30%丙烯酰胺单体液、浓缩胶缓冲液1M pH6.8的Tris缓冲液和分离胶缓冲液1.5M pH8.8的Tris缓冲液、10%过硫酸 俊、TEMED、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、样品处理液、染色液、脱色液操作步骤一、蛋白电泳用胶的配制1 .安装玻璃板。2 .按表1中给出的数值在一小烧杯中配制分离胶溶液。表2-1 SDS不连续电泳凝胶配方贮液分离胶/12%浓缩胶/3%30%丙烯酰胺单体贮液/mL4.00.85分离胶缓冲液 1.5M Tris/mL (pH8.8)2.5-浓缩胶缓冲液1M Tris /mL(pH6.8)-0.6双蒸水/mL3.43.510 %的SDS溶液/ L1005010

12、 %的过硫酸俊溶液/山158TEMED/ 人1083 .迅速在玻璃板的间隙中灌注丙稀酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需的空间。再在胶面上小心注入一层水（约 23 mm ）高，以阻止氧气进入凝胶溶液。4 .分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。5 . 按表 1 中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED， 马上开始聚合，故应快速操作。6 . 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。7 . 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1 ： 1 体积比加入样品处理液，在100 加热 5min 以使蛋白质变性。8 . 浓缩胶聚合完全后(

13、30-60 min ) ，小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。二、上样电泳1. 按预定顺序加样，加样量通常为1025山。电泳检测样品至少包括：蛋白Marker 、上样液(原液)、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM 咪唑冲洗液、100mM 咪唑冲洗液、250mM 咪唑冲洗液。2. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/ cm 。 当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/ cm ，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm ，然后关闭电源。3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的

14、方位。三、用考马斯亮蓝对SDS 聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色染色时间：现温度下不少于2h 。脱色需310小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记 录，应尽快对凝胶进行拍照。四、实验结果与讨论1、质粒的提取、酶切电泳图谱图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱1:酶切后的质粒 2:质粒 M : Marker 1、2:质粒 4、5:酶切后质粒观察结果：通过对比第三组和第四组电泳图谱，可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面，并且质粒泳道条带比较多；电泳条带模糊，呈凹凸形状，拖尾现象比较严重，不能很明显地观察结果。原因分析：(1)质粒泳道条带较多的原因可能是，质粒有的是超螺旋的

15、，有的可能是开环质粒，还有的形成各种聚合物，因此呈现多条条带。由于形成聚合物，分子量-可编辑修改-DNA被蛋白质或一些酶污染。糖的浓度可能不是很适合,、转化结果（培带的1Marker条带模糊，可以提高电泳效果;稠最适浓度；电泳时,条带最亮说明呈聚合状态的质粒的量是最多现象严重可能的原因有：电泳缓冲液最好现用应尽可能摸索出该质叵电压，而且电压不是很稳，电泳时间太长，可适的上样量是条带清晰的保证，条带模糊可能是阳 性 对 昭 八、阳性对照是将质粒转入感受态细 胞，此组正常情况下应产生大量菌落。 我们组的菌落效果总体比其他小组好， 这与涂布平板时的一些注意事项有关， 比如涂板的时候温度不要太高，无菌

16、操 作等。实验组菌落很多，说明菌液浓度有 点高，但是还是有明显的单菌落。但是 菌落培养时间有点长，影响因素可能有 培养基、培养条件、感受态细胞的质量-可编辑修改-阴 阴性对照是将酶切以后没有连接性 的质粒用于感受态细胞的转化。由于细 对 菌本身对外源DNA有降解作用，因此 照 目标基因在细菌里不能表达，因此不能 八、 看到菌落。口坐冲洗液在一块胶上一起电泳oM目标蛋白的SDS-PAGE1）电泳检测样品包括:2s/个小组将50mM咪唾冲洗液、io。Marker、上样液（原液）、上样后的穿透液、咪唾冲洗液、250mM 咪晚冲洗液。3）只有第二小组做了对照电泳，将未加 IPTG诱导的菌液进行了相应的

17、电45kD33kD图3-1目标蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱以Marker为临界线，右边是我们第四组的电泳图谱，左边是第三组的电泳图谱。1:破菌后的原液 2: 50mM 咪唾冲洗液 3: 100mM 咪晚冲洗液4: 250mM咪唾冲洗液23我们以第三组的穿柱液作为标本kDa-94.0-* 68245.01M 33.01:原液2:穿透液3: 50mM咪晚洗脱液4、100mM咪晚洗脱液5、250mM咪晚洗脱液图3-2对照组，未加IPTG诱导结果分析：1）通过SDS-PAGE鉴定图谱3-1我们可以看出，通过IPTG的诱导，我们成功得到了目标蛋白。通过与Marker 标准蛋白对比，可以看到目标蛋白分子

18、量在33kD-45kD之间；原液中含有大量的目标蛋白，穿柱液中没有，说明目标蛋白被吸附到了层析柱中。通过第三组和第四组结果的比对，可以看到第四组在不同浓度咪唑洗脱液得到的目标蛋白的量比第三组多，有可能是因为第四组加样量多于第三组，或者是50mM 没有完全洗脱便开始100mM 咪唑进行洗脱。2）我们从图谱中可以看出目标蛋白在50mM 咪唑洗脱液和100mM 咪唑洗脱液中被洗脱下的量是比较多的，因此我们可以在50-10mM 之间寻找最适咪唑液的浓度。3）图3-2是未加IPTG诱导目标蛋白产生的对照，通过与图 3-1对比，可以发现在33kD-45kD 之间没有蛋白条带的产生，而加IPTG 的组有明显的蛋白质条带，因此可知在诱导