浙科版高中生物选修一2.1《实验1：大肠杆菌的分离培养》 ppt课件

1、实验一实验一 大肠杆菌的培育和分别大肠杆菌的培育和分别大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧型的肠道杆菌。大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧型的肠道杆菌。水水无机盐无机盐碳源：有机碳如糖类、蛋白胨、牛肉膏碳源：有机碳如糖类、蛋白胨、牛肉膏 异养微生物所需的碳源异养微生物所需的碳源 无机碳如无机碳如 NaHCO3、 CaCO3 、 CO2 自养微生物所需的碳源自养微生物所需的碳源氮源：氮源：NO3-、NH4+、NH3 、含氮有机物、含氮有机物 为不能固氮的微生物所需氮源为不能固氮的微生物所需氮源 N2 固氮微生物所需氮源固氮微生物所需氮源生长因子：维生素、氨基酸、碱基有机小分子生长因子：维生素、氨基酸、碱基

2、有机小分子 不同的微生物所需的生长因子不同不同的微生物所需的生长因子不同二、微生物的营养二、微生物的营养三、培育基的种类三、培育基的种类物理性质物理性质液体培育基液体培育基半固体体培育基半固体体培育基固体体培育基固体体培育基细菌扩增和培育细菌扩增和培育工业消费工业消费保管、鉴定菌种保管、鉴定菌种察看微生物运动察看微生物运动平板：分别、鉴平板：分别、鉴别、挑选、计数别、挑选、计数斜面：保管斜面：保管思索：思索：物理性质物理性质液体培育基液体培育基半固体体培育基半固体体培育基固体体培育基固体体培育基1、假设要将混在一同的圆褐固氮菌和酵母菌分别，应选？、假设要将混在一同的圆褐固氮菌和酵母菌分别，应选

3、？2、假设要察看肺炎双球菌的运动情况，应选？、假设要察看肺炎双球菌的运动情况，应选？3、请为某啤酒厂选择保管酵母菌菌种的培育基？、请为某啤酒厂选择保管酵母菌菌种的培育基？4、请为某青霉素消费厂选择消费用的培育基？、请为某青霉素消费厂选择消费用的培育基？二根据化学成分分二根据化学成分分合成培育基合成培育基成清楚确成清楚确天然培育基天然培育基成分不明确成分不明确三根据培育基的用途分三根据培育基的用途分1.1.根底培育基根底培育基LBLB培育基培育基: :含有普通细菌生长含有普通细菌生长繁衍需求的根本的营养物质。最常用的根底培繁衍需求的根本的营养物质。最常用的根底培育基是上面提及的天然培育基中的牛肉

4、膏蛋白育基是上面提及的天然培育基中的牛肉膏蛋白胨培育基。胨培育基。2.2.营养培育基加富培育基营养培育基加富培育基: :在根底培育基中在根底培育基中参与某些特殊营养物质，如血液、血清或生长参与某些特殊营养物质，如血液、血清或生长因子等。用以培育对营养要求高的微生物。因子等。用以培育对营养要求高的微生物。普通普通(普通普通) 培育基培育基A.青霉素培育基青霉素培育基可将霉菌、放线菌与细可将霉菌、放线菌与细菌等别分开来。菌等别分开来。能将以尿素为氮源的能将以尿素为氮源的微生物分别出来微生物分别出来C.无氮培育基无氮培育基可将能固氮的和不能固可将能固氮的和不能固氮的微生物别分开来。氮的微生物别分开来

5、。B.添加尿素添加尿素4.鉴别培育基鉴别培育基普通培育基普通培育基参与某物质参与某物质A菌落菌落 B菌落菌落菌液菌液A菌菌B菌菌接种接种微生物的微生物的代谢特点代谢特点参与化学物质参与化学物质代谢产物与参与的化代谢产物与参与的化学物质发生特征性反学物质发生特征性反响响思索：思索：1、该培育基根据其化学成分分是什么培育基？、该培育基根据其化学成分分是什么培育基？编号成分 蛋白胨蛋白胨（NHNH4 4) )2 2SOSO4 4K K2 2HPOHPO4 4MgSOMgSO4 4FeSOFeSO4 4CaClCaCl2 2H H2 2O O含量10g10g0.4g0.4g4.0g4.0g9.25g9

6、.25g 9.25g9.25g 0.5g0.5g 100ml100ml2、该培育基可用以培育哪些代谢特点的微生物？、该培育基可用以培育哪些代谢特点的微生物？3、该培育基可用于选择培育固氮菌吗？、该培育基可用于选择培育固氮菌吗？可以如何改造？可以如何改造？四、无菌操作四、无菌操作(1)各种器皿必需是无菌的各种器皿必需是无菌的(2)各种培育基必需是无菌的各种培育基必需是无菌的(3)接种等操作过程要防止杂菌污染接种等操作过程要防止杂菌污染1 1消毒定义：消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。微生物的过程。消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概

7、念及两者的区别 2 2灭菌的定义：灭菌的定义：以化学或物理方法消灭一切微生物，包括以化学或物理方法消灭一切微生物，包括一切细菌的繁衍体、芽孢、霉菌及病毒，而到一切细菌的繁衍体、芽孢、霉菌及病毒，而到达完全无菌的过程。达完全无菌的过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关任务中最普灭菌与消毒技术是微生物有关任务中最普通也是最重要的技术。通也是最重要的技术。P213常用的消毒和灭菌的方法：常用的消毒和灭菌的方法：1.高压蒸汽灭菌：器皿、普通的培育基高压蒸汽灭菌：器皿、普通的培育基2.灼烧灭菌：接种环灼烧灭菌：接种环3.G6玻璃砂漏斗过滤：含尿素等受热分玻璃砂漏斗过滤：含尿素等受热分解的培育基解的培育基4.

8、紫外线灭菌：空气紫外线灭菌：空气5.酒精等化学药剂消毒：生物资料、实验员酒精等化学药剂消毒：生物资料、实验员的手的手1 1、划线分别法、划线分别法 (1) (1)接种环灼烧、冷却、蘸取菌液；接种环灼烧、冷却、蘸取菌液； (2) (2)在平板上第一次划线；在平板上第一次划线； (3) (3)接种环灼烧、冷却后直接从第一接种环灼烧、冷却后直接从第一次划线末端开场第二次划线，反复次划线末端开场第二次划线，反复3 3次；次； (4) (4)将培育皿倒置，无菌培育将培育皿倒置，无菌培育24h24h，在划线末端出现单菌落。在划线末端出现单菌落。 倒置缘由：防止冷凝水滴落污染培育基，达不倒置缘由：防止冷凝水

9、滴落污染培育基，达不到分别的目的。到分别的目的。2 2、涂布分别法、涂布分别法两法比较：课本两法比较：课本P20划线分别法：方法简单，但不易构成单菌落划线分别法：方法简单，但不易构成单菌落涂布分别法：单菌落更易分开，便于记录，涂布分别法：单菌落更易分开，便于记录，但操作复杂些。但操作复杂些。大肠杆菌的培育和分别实验步骤：课本大肠杆菌的培育和分别实验步骤：课本P22-23将将LB液体和固体培育基及培育皿高压蒸液体和固体培育基及培育皿高压蒸汽灭菌汽灭菌将灭菌后冷却到将灭菌后冷却到60的的LB固体培育基倒固体培育基倒入灭菌过的培育皿中，制造平面培育基入灭菌过的培育皿中，制造平面培育基.将大肠杆菌从斜

10、面接种到将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培育基液体培育基中，然后在中，然后在37摇床中震荡培育摇床中震荡培育12h。用接种环取震荡培育后的菌液，并在固用接种环取震荡培育后的菌液，并在固体培育基上划线，然后将划线后的培育体培育基上划线，然后将划线后的培育皿倒置与皿倒置与37的恒温培育箱中培育的恒温培育箱中培育1224h，察看划线末端的菌落生长情况，察看划线末端的菌落生长情况.用接种环取单菌落，用划线法接种于斜用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在面上，在37的恒温培育箱中培育的恒温培育箱中培育24h，再放入再放入4的冰箱中保管的冰箱中保管 。未稀释未稀释稀释稀释各种器皿必需是无菌的各种器皿必需

11、是无菌的 高温蒸汽灭菌锅灭菌：高温蒸汽灭菌锅灭菌： 培育皿、试管、三角瓶、取样器头枪头、培育皿、试管、三角瓶、取样器头枪头、tip、移、移液管、三角刮刀、接种环、镊子等等，一切容器都必需液管、三角刮刀、接种环、镊子等等，一切容器都必需封口，其他用品用牛皮纸或报纸包好灭菌。各种器皿在封口，其他用品用牛皮纸或报纸包好灭菌。各种器皿在1kg/cm2压力下，压力下，121度灭菌度灭菌20min。留意，脱脂棉不。留意，脱脂棉不能运用。能运用。 灭菌后，在灭菌后，在6080度烘箱中除去水分度烘箱中除去水分 运用前灭菌：运用前灭菌： 放置在超净任务台上，翻开紫外灯和过滤风，灭菌放置在超净任务台上，翻开紫外灯

12、和过滤风，灭菌30min培育基必需是无菌的培育基必需是无菌的 普通参与培育基的三角瓶、试管，也是在普通参与培育基的三角瓶、试管，也是在1kg/cm2压力，压力，121灭菌灭菌20min。 如含葡萄糖，为防止葡萄糖降解，要用如含葡萄糖，为防止葡萄糖降解，要用500g/cm2压力灭菌压力灭菌30min。 如含不能加热的化合物，如尿素，那么如含不能加热的化合物，如尿素，那么用用G6玻璃砂漏斗过滤。玻璃砂漏斗过滤。 普通培育基都是整体灭菌后，再在超净普通培育基都是整体灭菌后，再在超净任务台上分装在培育皿和试管中。任务台上分装在培育皿和试管中。菌转移过程要防止杂菌污染菌转移过程要防止杂菌污染1、超净任务

13、台的运用、超净任务台的运用 超净台中是正压，鼓风机送入经过过滤的空气。超净台中是正压，鼓风机送入经过过滤的空气。超净台内常有的物品：广口瓶含超净台内常有的物品：广口瓶含70%酒精的棉球，酒精灯，酒精的棉球，酒精灯，酒精浸泡的镊子、玻璃刮刀等只能公用，不能经常移入酒精浸泡的镊子、玻璃刮刀等只能公用，不能经常移入移出。移出。超净台有紫外线灭菌灯，可使蛋白质和核酸变性，芽孢可超净台有紫外线灭菌灯，可使蛋白质和核酸变性，芽孢可在在10min内杀死。翻开紫外灯后，人必需分开。内杀死。翻开紫外灯后，人必需分开。30min后封锁。后封锁。接种操作前，用酒精棉球擦拭台面后，转入转接用物品。接种操作前，用酒精棉

14、球擦拭台面后，转入转接用物品。2、无菌操作、无菌操作翻开滤风机，点燃酒精灯翻开滤风机，点燃酒精灯用酒精棉球擦拭双手。翻开培育皿、试管外包纸，平放。用酒精棉球擦拭双手。翻开培育皿、试管外包纸，平放。转接过程中：转接过程中： 瓶塞和封口膜只能夹持手上，不许落台面；瓶塞和封口膜只能夹持手上，不许落台面； 操作过程在酒精灯火焰旁操作；操作过程在酒精灯火焰旁操作； 接种环接种前，环头烧红，环柄火焰上穿越接种环接种前，环头烧红，环柄火焰上穿越12次，放次，放入试管和培育皿中稍冷却后接触菌落或菌液，运用终了入试管和培育皿中稍冷却后接触菌落或菌液，运用终了后，反复运用前操作，防止菌外泄；后，反复运用前操作，防

15、止菌外泄； 运用玻璃刮刀和镊子时，从酒精中取出后燃尽其上酒精运用玻璃刮刀和镊子时，从酒精中取出后燃尽其上酒精即可。即可。灭菌与消毒灭菌与消毒 杀死或除去一切微生物的方法杀死或除去一切微生物的方法灭菌灭菌 杀死病原菌的方法杀死病原菌的方法消毒消毒 灭菌方法分类灭菌方法分类 1干热灭菌法火焰灼烧、干热灭菌法火焰灼烧、140160烘箱加热烘箱加热23h 2湿热灭菌法高压蒸气灭菌法、间歇灭菌法湿热灭菌法高压蒸气灭菌法、间歇灭菌法 3过滤灭菌法尿素、过滤灭菌法尿素、NaHCO3等加热会分解的化合等加热会分解的化合 物。用物。用G6玻璃砂漏斗过滤。玻璃砂漏斗过滤。G1G5不能除菌不能除菌 4紫外光灭菌法紫

16、外光谱范围是紫外光灭菌法紫外光谱范围是100400nm；灭；灭菌最菌最 有效的波长为有效的波长为253.7nmDNA的吸收区的吸收区 5化学药剂灭菌法氧化剂、金属盐类、有机化合物化学药剂灭菌法氧化剂、金属盐类、有机化合物高压灭菌锅的运用高压灭菌锅的运用1 1首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内参与适量的首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内参与适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。水，使水面与三角搁架相平为宜。 2 2放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。留意不要装得太放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。留意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口

17、端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。纸而透入棉塞。 3 3加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。使螺栓松紧一致，勿使漏气。 4 4用电炉或煤气加热，并同时翻开排气阀，使水沸腾用电炉或煤气加热，并同时翻开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力添加而逐渐上升。排气阀，让锅

18、内的温度随蒸汽压力添加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。由于空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀至所需时间。由于空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于压，所以，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。饱和蒸汽的温度。 5 5灭菌所需时间到后，切断电源或封锁煤气，让灭菌灭菌所需时间到后，切断电源或封锁煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0 0时，翻开时，翻开排气阀，旋松螺栓，翻开盖子，取出灭菌物品。假排气阀，旋松螺栓，翻开盖子，取出灭菌

19、物品。假设压力设压力 未降到未降到0 0时，翻开排气阀，就会因锅内压力时，翻开排气阀，就会因锅内压力忽然下降，使容器内的培育基由于内外压力不平衡忽然下降，使容器内的培育基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，呵斥棉塞沾染培育基而发而冲出烧瓶口或试管口，呵斥棉塞沾染培育基而发生污染。生污染。 6 6将取出的灭菌培育基放入将取出的灭菌培育基放入 37 37温箱培育温箱培育2424小时，小时，经检查假设无杂菌生长，即可待用。经检查假设无杂菌生长，即可待用。微生物的培育与分别总结微生物的培育与分别总结第一步第一步: 配制培育基配制培育基根据培育目的如鉴别根据培育目的如鉴别/分别分别/扩增扩增/育种育

20、种根据微生物的类型细菌根据微生物的类型细菌/真菌真菌/放线菌放线菌微生物的代谢类型自养微生物的代谢类型自养/异养，固氮异养，固氮/不固氮不固氮计算计算称量称量溶解溶解调理调理PH操作过程：操作过程：本卷须知：本卷须知：微生物的培育与分别总结微生物的培育与分别总结第二步第二步: 灭菌灭菌培育基培育基各种器皿各种器皿干热灭菌法；湿热灭菌法；过滤灭菌法；干热灭菌法；湿热灭菌法；过滤灭菌法；紫外光灭菌法；化学药剂灭菌法紫外光灭菌法；化学药剂灭菌法方法：方法：灭菌对象：灭菌对象：第三步第三步: 倒平板倒平板在酒精灯旁，倒入后振荡，在酒精灯旁，倒入后振荡，冷却后倒置，防止冷凝水冲冷却后倒置，防止冷凝水冲散

21、菌落。散菌落。方法：方法：微生物的培育与分别总结微生物的培育与分别总结第四步第四步: 分别分别灼烧接种环灼烧接种环醮取菌液醮取菌液划线四次四个划线四次四个方向，每次都要灼烧方向，每次都要灼烧划线分别法：划线分别法：微生物的培育与分别总结微生物的培育与分别总结稀释涂布分别法：稀释涂布分别法：振荡振荡多次稀释菌液多次稀释菌液将将0.1ml不同稀释倍数不同稀释倍数的菌液均接种在固体培育基上的菌液均接种在固体培育基上用三角刮刀涂布用三角刮刀涂布第五步第五步: 培育培育37恒温培育恒温培育,可得单菌落可得单菌落1、1固体固体 补充无机盐、调理浸透压补充无机盐、调理浸透压 6.57.5 2稀释涂布分别稀释

22、涂布分别 划线分别划线分别 倒置倒置 单菌落单菌落3纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶 4灭菌灭菌2、1y=9x 2无菌水无菌水 不会不会 由于细菌有细胞壁由于细菌有细胞壁 3振荡振荡 偏大偏大 4倒扣倒扣 51.7108 6能够是由于培育时间过长，导致长的较能够是由于培育时间过长，导致长的较快的培育基在营养被耗尽的情况下，菌量不快的培育基在营养被耗尽的情况下，菌量不再增多，而较慢的培育基的菌的菌体数量随再增多，而较慢的培育基的菌的菌体数量随后赶上呵斥。缩短培育的时间或增大培育基后赶上呵斥。缩短培育的时间或增大培育基的量的量菌落和菌种种类的识别 菌落是由微生物在适宜固体培育基外表或内菌落是由微生物在适宜固体培育基外表或内部生长繁衍到一定程度，构成肉眼可见有一部生长繁衍到一定程度，构成肉眼可见有一定形状构造的子细胞的群落。由单个菌开展定形状构造的子细胞的群落。由单个菌开展成的菌落即为单菌落。成的菌落即为单菌落。 各种微生物在一定条件下构成的菌落特征各种微生物在一定条件下构成的菌落特征如大小、外形、边缘、外表、质地、颜色如大小、外形、边缘、外表、质地、颜色等具有一定的稳定性，是衡量菌种纯度、等具有一定的稳定性，是衡量菌种纯度、识别和鉴定菌种的重要根据。菌落特征与