检验方法的验证、确认步骤及详细计算方法

1、检验方法的验证、确认步骤及详细计算方法一、检验方法验证的根本内容检验方法验证的根本内容包括方案的起草及审批,检测 仪器确实认.适用性验证包括准确度试验、精密度测定、线性范围 试验、专属性试验等和结果评价及批准四个的方面.二、检验方法验证的根本步骤首先是制定验证方案,然后对大型精密仪器进行确认, 最关键的一步是检验方法的适用性试验,最后是检验方法评 价及批准.1、验证方案的制定检验方法的验证方案通常由质量验证小组提由.根据产 品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有 关资料,提由规格标准,确定检查工程,规定杂质限度,即为质量标准草案.根据质量标准草案确定检查和试验范围,对检验方法拟

2、定具体操作步骤,最后经有关人员审批方可实施.2、大型精密仪器确实认分析测试中所用的检测仪器一般可分为三类：A、普通仪器：崩解仪,折光仪、分析天平、酸度计、 溶点测定仪、电导仪等：B、较精密仪器：旋光仪、永停滴定仪、费休氏水分测 定仪、自动滴定仪、药物溶生度仪、可见分光光度计、电 泳仪等；C、大型精密仪器：紫外分光光度计、红外分光光度计、 气相色谱仪、高效液相色谱仪、薄层扫描仪等.为了保证分析测试数据准确可靠,每台检测仪器在投入正式使用之前都应进行确认.检测仪器确实认是检验方法验证的根底,应在其它验证 试验开始之前首先完成.检测仪器确认工作内容应根据仪器类型.技术性能而 定,通常包括：安装确认、

3、校正、适用性预试验和再确认.3、校正校正是仪器确认及检验方法验证中的一个重要环节,应 当在验证试验以前进行校正.紫外分光光度计校正包括波长 校正、吸收度测试、准确度测试、杂散光检查.气相色谱仪与高效液相色谱仪均要求做系统适用性试 验.在规定的色谱条件下测定色谱柱的最小理论塔板数.分 离度和拖尾因子,并规定变异系数应不大于2% o对于化学检验中使用的计量仪器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均应校正4、适用性预试验仪器的安装确认完成以后,在其功能试验符合要求的情 况下,应用标准品或对照品对其进行适用性检查,以确认仪 器是否符合使用要求.例如对熔点测定仪的适用性预试验是采用溶点的 甲硝嚏做试验

4、,测试结果与熔点比拟.紫外分光光度计可用含量的莫标准品试验,测得结 果与数值比照,确定仪器是否符合使用要求.在完成上述各项试验工作的同时,应做好相应的文件记 录等资料归档工作,每一台仪器均应有一套完整的档案资 料.5、再确认为了保证仪器处于良好的使用状态,对于一台新购置的 仪器在确认工作结束以后,应根据仪器的类别.确认的经验 制定再确认的方案.再确认的时间间隔和内容要根据仪器类别和使用情况 决定,一般是3个月、6个月或1年.仪器再确认的内容通常包括线路连接、附件备品消耗检 查、清洁工作、功能试验、工作日记等,其中重点安装确认 中的功能试验.三、检验方法的适用性验证药品质量标准分析方法验证的目的

5、是证实采用的方法 适合于相应的检测要求.在起草药品质量标准时,分析方法需经验证：在药物生 产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时,那么 质量标准分析方法也需进行验证.方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草或修订 说明乜根据?中国药典?附录 XIXA的原那么要求,检验方法的 验证可分为三种情况处理；1、无需验证的方法.如药典 包括USR ER CR JP等 各国药典的方法,一般只做系统适用性试验,以确认系统 是否符合要求主要指仪器稳定性及柱的别离度是否达标.2、比照法.已在参比实验室验证过的分析方法,可用 比照试验的方法来确认方法的可靠性,即将本实验室与参比 实验室用同一方法对同批样

6、品所测数据进行比拟如至少取五个批号,每批重复测定五次 ,判断方法在本实验室的可 行性.如有差异需查明原因或设计方案,对方法进行再验证.3、需进行系统验证的方法.四、检验方法的评价及批准安装确认及适用性试验结束后,应将试验数据资料进行 汇总分析.对检验方法作由正确的评价,验证报告的说明及 结论局部应简明扼要.试验中的主要偏差应有适当解释.然后,报主管领导审 批.检验方法验证的最终产物是一个经过验证的方法一根据 验证的结果制订的由有关领导批准的检验方法.五、如何详细计算检由限？在如何正确或准确地估算检由限的问题上,国际分析界一直存有争议.检由限的特殊意义在于可以对一个给定的分析方法在低浓度水平的检

7、测水平进行准确地评估,而考察一 个分析方法在低浓度范围的检测性能,可以基于不同的角度或不同的侧重点,如可以从最小信号值与仪器噪音之比来考察,从方法测定空白的平均波动性来统计估算,也可以根据分析方法校准曲线的偏差特性来定量估算等等.检由限是评价一个分析方法及测试仪器性能的重要指 标,所谓“检生是指定性检由,即判定样品中存在有浓度 高于空白的待测物质.ACS美国化学学会对这一定义作了更简明的概括：检由限是一个分析方法能够可靠地检测由被分析物的最低浓 度.1、检测限limit of detection, LOD 定义：在样品中能检由的被测组分的最低浓度量称为检测限,即产生信号峰高为基线噪音标准差k倍

8、时的样品浓度,一般为信噪比S/N 2:1或3:1时的浓度,对其测定的 准确度和精密度没有确定的要求.目前,一般将检测限定义 为信噪比S/N 3:1时的浓度.2、计算公式为:D=3N/S (1)式中：N口音；S 检测器灵敏度；D检测限而灵敏度的计算公式为：S=I/Q (2)式中： S灵敏度；I信号响应值； Q 进样量将式(1)和式(2)合并,得到下式：D=3NX Q/I (3)式中：Q进本¥量；N噪音；I 信号响应值. I/N即为该进样量下的信噪比(S/N),该信噪比可通过工作 站对图谱进行自动分析获得,一般的色谱或质谱工作站都可 进行信噪比分析计算.这样检测限的计算方法就变得非常方

9、便了.3、计算方法:实际计算时,检由限有 2种表示方法：一种是进样瓶中 样品检测限,一种是针对原始样品的方法检由限.A、对第一种检测限,只要知道进样量和信噪比即可计 算.如进样瓶中样品浓度为1 mg/L,在此浓度下的信噪比为300(由工作站分析获得),那么其检测限为：D =(3X1 mgL-1 ) /300 = 0.01 mg/L .也可用绝对进样量表示,假设进样体积为 10 ul ,那么其检测限为：D = 3 X ( 1 mgL-1 X 10 ul ) /300 =0.1 ng.B、对第二种表示方法,需同时考虑原始样品的取样量 和提取样品的定容体积.仍按前述样品计算,假设取样量为 5 克,最

10、后定容体积为 5 mL那么方法检测限为：D = 0.01 mgL-1 X 5 mL/5 g = 0.01 mg/kg .即当原始样品中待检物质的浓度为0.01mg/kg时,假设取样量为5g,样品经前处理后定容体积为5mL时,进样瓶中样品的浓度可达0.01mg/L (假定回收率为100%,此时,在其它 给定的分析条件下,能产生3倍噪声强度的信号.在实际检测工作中,第二种表示方法更为常见.4、考前须知由式(3)可见,信噪比的大小直接关系到检测限的大 小.信噪比计算方法的不同,具比值大小有很大不同,这与 计算信噪比时基线噪声峰值的定义方式有关,一般有三种不 同的定义：A、峰/峰(peak to pe

11、ak )信噪比,用莫一段基线噪声 的平均高度；B、峰/半峰(half peak to peak )信噪比,用奥一段 基线噪声平均高度的1/2 ;C、均方根(RMS信噪比,用莫一段基线噪声的均方根 值计算.除此之外,信噪比的计算结果还和所取噪声的位置有很 大关系,取信号哪一侧基线的噪声,取多长一段基线上的噪般多取样声,计算结果都很不完全相同,有时相差甚远 品峰两侧的噪声峰值计算.5、检由限确实定A、?全球环境监测系统水监测操作指南?中规定：给定 置信水平为95%寸,样品测定值与零浓度样品的测定值有显 著性差异即为检由限：L = 4.6Sb式中：L方法的最低检由浓度.Sb 测定次数为 n次的空白平

12、行测定批内标准 差重复测定20次以上.B、国际纯粹和应用化学联合会IUPA.规定对各种光 学分析方法,可用下式计算：L = KSb/SL方法的最低检由浓度Sb空白屡次测量的标准偏差吸光度S 方法的灵敏度即校准曲线的斜率为了评估,空白测定次数必须足够多, 最好能测20次 国际纯粹和应用化学联合会竭力提倡取 k值为3, 一般来说, 取相应的置信水平大约为 90%假设=0 ,并不意味着,或检由限无限小.这时需配制一 个浓度略大于零浓度的试样系列能产生一个可测信号值 代替全程序空白试验,求由其标准偏差,用来代替 .止匕外,有时为了工作方便和便于比拟,也规定一个大家 能接受的信号值作为检由限,如分光光度

13、法中,规定吸光度 为0.010所对应的浓度即为检由限 LoC、美国EPA SW846规定方法中的检由限为：L=3.143SbD、莫些分光光度法是以吸光度扣除空白为0.010相对应的浓度值或绝对量为检由限,这是一种实验室间的协 定方案.E、气相色谱法：检测器恰能产生与噪音相区别的响应 信号时所需进入色谱的物质最小量为检由限,一般为噪音的 二倍.F、离子选择电极法：当校准曲线的直线局部外延的延 长线与通过空白电位且平行于浓度轴的直线相交时,其交点 所对应的浓度值即为该离子色谱所对电极法的检由限.由测得的空白值计算生的 L值不应大于分析方法规定的 最低检由浓度值,如大于方法规定值时,必须寻找原因降低 空白值,重新测定计算至合格.6、校正曲线绘制：A、按分析方法步骤,通过实测浓度和仪器信号值的直 线关系,确定实验室条件下的测定上限.当