光谱的概念ppt课件

1、光谱分析的基本概念光谱分析的基本概念1概述概述2光谱的基本理论光谱的基本理论3光谱仪器的基本结构与功能光谱仪器的基本结构与功能4光谱分析的基本方法光谱分析的基本方法5影响光谱分析的主要因素影响光谱分析的主要因素1概述概述1.1什麽叫光分析什麽叫光分析? 凡是利用辐射能与待测物质相互作用后产生的辐射信号或引起信号的变化而采用的分析方法称为光分析。1.2光谱的分类：光谱的分类： 光分析又可分为非光谱分析和光谱分析两类。(1)光谱分析光谱分析：是以光吸收、发射和散射等作用而建立起来的光分析方法，称为光谱分析。它是通过光的波长和强度对物质进行分析的方法。属于这类分析的有原子吸收光谱、分子吸收光谱、紫外

2、可见吸收光谱、红外吸收光谱、荧光发射光谱、化学发光、生物发光等。(2)非光谱分析非光谱分析：是一些不以光的波长为特征信号的分析方法，只是通过测量电磁辐射的某些基本性质(反射、折射、干涉、衍射、偏振等)的变化的分析方法。属于这类分析的有折射法、干涉法、散射法、旋光法，X衍射法。1.3光谱分析的特点：光谱分析的特点： 灵敏度高：可达1021/g 应用广：适用于许多化合物的分析鉴定 专一性强：对物质的特殊结构在特定的条件下发生特异性吸收1.2光谱分析的模式：光谱分析的模式： 1.2.1比色分析比色分析 在一定浓度范围内,溶液中有色物质的浓度与溶液颜色的深浅成正比.根据溶液颜色的深浅度,测定溶液中有色

3、物质含量的方法,称为比色分析法. 1.2.2分光光度分析分光光度分析： 分光光度分析法是根据溶液中被测物质对不同波长光的吸收能力强弱进行的分析方法.通过该物质的吸收光谱曲线的特征来鉴别物质的分析方法。1.3光谱分析常用的符号及其物理意义光谱分析常用的符号及其物理意义(1). I0 : 入射光强度, 提供稳定的光源(单色光)(2). I : 透过单色光, 透过光量的大小与溶液浓度和光程有关(3). L: 光程, 指光在溶液中经过的实际距离,常用cm表示(4). C: 溶液浓度, 常用摩尔浓度或百分浓度表示(5). T: 透光度,又称透光率,是透过光和入射光强度的比值(6). T% : 透过光的百

4、分率,在比色分析中,将透过一定量光视为100%(7). K: 消光系数,是指溶液对光吸收的比例常数,是指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值. K值取决于溶质性质,入射光波长和温度(8). A: 吸光率,又称光密度(O.D.)或消光度(E),表示溶液吸收光的强弱或吸收程度,A值越大溶液对光吸收的程度越大(9).: 摩尔消光系数,溶液浓度为1mol/L,光程厚度为1cm时的消光系数,其单位是L/mol.cm 值是物质的特征常数,由物质的性质与待测光波长而定. 同一物质在不同的波长所测得的值不同.一般采用值最大的波长进行比色测定.(10). E%1cm百分消光系数, 是指被测物质的浓度以百分浓

5、度(W/V)表示时的消光系数。当溶液浓度为1g/100ml,光程为1cm时的消光系数,其单位是100ml/g.cm.如：trypsin, E%1cm = 13.5, 溶液浓度为1g/100ml,光程为1cm,波长为280nm时，其百分消光系数A = 13.5 E%1cm值是生物大分子常用的消光系数，由于生物大分子的分子量太大，一般不用mol浓度，而用百分浓度表示，所以测定时用E%1cm，它是表示生物大分子的一个特征常数。(11)S-桑德尔(Sanddl)常数，表示在单位截面积内能检出物质的最低含量，单位用ug/cm2表示。后来人们将此概念用来表示光学仪器的灵敏度，S被定为仪器检测的最小极限，S

6、值越小仪器的灵敏度越高。1.4.光谱分析的术语：光谱分析的术语：1.4.1 单色光单色光： 当一束混合光通过分光器后被分成单一波长的光,称为单色光。1.4.2光的互补性光的互补性： 有色溶液与相应的单色光生成新的互补色 绿 黄 青 橙 白光 青蓝 红 蓝 紫1.4.3 朗伯朗伯-比耳定律比耳定律(Lambert-Beer)也称之为光吸收定律 A = KCL 朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度L和浓度C对光吸收的关系,其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质而定.1.4.4发射光谱发射光谱: 物质经辐射能照射被激发后，系统内以光的形式释放多余的能量产生相对应波长产生的光谱。 1.4.5吸收光谱吸收光

7、谱： 物质在辐射能的照射下，系统吸收的能量所对应的波长产生光谱.1.4.6散射光谱散射光谱： 物质经辐射能照射后,系统内散射出来的能量产生相对应的光谱. 2光谱分析的基本理论光谱分析的基本理论2.1光谱产生的过程光谱产生的过程 构成物质的分子，原子或离子经辐射能照射后物质的总能量就会发生变化，在能量相互转化的过程中产生辐射信号或引起辐射信号变化。根据产生的辐射信号或引起信号变化，均可进行光谱分析。2.2光谱的分类光谱的分类 (1)发射光谱发射光谱: 构成物质的分子，原子或离子，受热能或电能激发后系统发射的能量对应的波长产生的图谱。发射光谱又分为线光谱、带光谱、连续光谱. a.线光谱线光谱: 原

8、子或离子被激发产生的光谱,称原子光谱或离子光谱。它是由不连续的明亮线条所组成光谱。 b.带光谱带光谱: 分子被激发产生的光谱，称分子光谱。它是由数个光带与暗区相间所组成光谱。 c.连续光谱连续光谱: 阳光或灯光所发的光谱。它是由长短波长连续不断顺序排列组成光谱。(2).吸收光谱吸收光谱 ： 物质受光照射后，系统吸收的能量所对应的波长图谱 。吸收光谱又分为原子吸收光谱、分子吸收光谱 a.原子吸收光谱原子吸收光谱：原子受光照射后吸收能量产生的光谱,称原子吸收光谱。它是由不连续的明亮线条所组成光谱。 b.分子吸收光谱分子吸收光谱：分子受光照射后吸收能量产生的光谱，称分子吸收光谱。是由数个光带与暗区相

9、间所组成光谱 c 光吸收光吸收: 介质有选择地吸收某些波长的光,经棱镜色散后所得到的光谱中,就出现一处或几处暗的部分。这种通过介质的透过光谱就称为吸收光谱,可见-紫外分光光度法是分子吸收光谱,属带状光谱。(3)散射光谱散射光谱： 散射光谱主要是以拉曼散射为基础形成的光谱，它分布在红外区属于分子散射光谱。 拉曼散射是当一束单色光与分子相互作用时，发生非弹性碰撞，光子与分子之间发生能量交换，光子不但改变了运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子或分子的振动和转动能量传递光子，而改变了光子的频率，这种散射过程称为拉曼散射过程。 原子基态 激发态电子低能轨道 高能级轨道分子基态 激发态 低能级 高能级

10、在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。上图为分子的能级示意图。分子总能量：E分子 = E电子 + E振动 + E转动2.3分子吸收光谱的产生分子吸收光谱的产生(1)分子的总动能分子的总动能物质的分子吸收一定波长的光产生特征吸收光谱,称为分子吸收光谱(分子吸收光谱比较复杂)。不同能量的电磁波,可转变为分子不同运动能。产生不同的能级，由相应的能级产生相应的分子光谱。(2)分子的能级与光谱分子的能级与光谱: 平动能 平动能级 转动能 转动能级 分子的转动光谱 振动能 振动能级 分子的振动光谱 电子运动能 电子运动能级

11、分子的电子光谱 2.4分子光谱的分类分子光谱的分类(1) 分子转动光谱分子转动光谱:光子的能量被分子吸收后,转变成分子的转动能,引起整个分子转动,由原来的转动能级跃迁到较高的转动能级的过程中,只吸收某一定能量的光子,从而产生吸收光谱. 分子转动能级差在E = 0.05eV左右,远红外及微波区属分子转动光谱(2)分子振动光谱分子振动光谱: 光子的能量被分子吸收后,转变成分子的振动能,引起整个分子振动, 从而产生吸收光谱.转动能级差在E = 0.05-1.0eV,中红外属分子振动光谱 (3) 分子的电子光谱分子的电子光谱: 光子的能量被分子吸收后,转变成分子的电子动能, 由原来的电子能级跃迁到较高

12、的电子能级, 从而产生吸收光谱. 分子转动能级差在E = 1.0-2.0eV,可见光,紫外及远紫外属分子的电子光谱 在生物化学分析中,最常用的光谱分析是分子的电子光谱.下面着重介绍分子的电子光谱.2.5分子的电子吸收光谱的机理分子的电子吸收光谱的机理(1).分子的化学键与电子分子的化学键与电子 有机化合物及生物大分子的紫外和可见光吸收光谱,取决于组成化合物的化学键及形成化学键的价电子.主要有以下三类形式。 H H HCCCH H O Ha. 形成单键的电子b. 形成双键的电子c. 未形成化学键的n电子(未共享的电子对)(2). 电子跃迁的方式电子跃迁的方式a.-: 在饱和价化合物中只有-的跃迁

13、,这种跃迁需要很高的能量. 因此,吸收光谱出现在远紫外区(小于170nm),如:甲烷,在125nmb.-: 这种未成键电子跃迁到高能轨道也需要很高的能量, 因此,吸收光谱出现在远紫外和紫外区(170-400nm),如 三甲胺,在225nmc.-: 含双键的化合物的电子跃迁需要的能量较小,吸收光谱出现在近紫外和紫外区(200-400nm),如苯,在203nmd. n-:这种未成对的电子跃迁需要的能量更小,吸收光谱出现在近紫外和可见光区(200-750nm),如 亚硝基-n-丁烷, 在665nm2.6化合物中的发色基团及助色基团化合物中的发色基团及助色基团2.6.1发色基团发色基团:有机化合物的某

14、些基团,在紫外或可见光区有特殊的吸收峰,这些基团称为发色团(Chromophoric group)表一表一:常见的发色基团常见的发色基团 化合物发色基团吸收峰波长溶剂CH3COCH3酮基270.6乙醇CH3COH醛基293.4乙醇CH3COOH羧基204.0水CH3CONH2酰胺基208.0水CH3COCH硝基300.7乙醚C4H9NO亚硝基271.0乙醚C6H11SOCH3硫醚210.0乙醚C6H5CS C6H5硫醇620.0乙醚2.6.2助色基团助色基团:有机化合物的某些基团本身并不产生吸收峰,但与发色团同存于一分子中时,能引起吸收峰的位移和吸收强度改变,这些基团称为助色团(auxochr

15、omic group)。表二表二:常见的助色基团常见的助色基团 化合物取代基吸收峰波长苯 254.3甲苯甲基262.0氯代苯氯264.0苯甲酸羧基267.0苯酚羟基273.0苯胺胺基284.5 如苯的主要吸收峰是254.3nm,但苯分子中的一个氢 原子被甲基取代后生成甲苯,后者的主要吸收峰是262nm,吸收峰向波长长的方向发生位移,亦称向红发生位移. 如果吸吸收峰向波长短的方向发生位移,亦称向紫发生位移.3紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计3.1基本结构及各部件功能基本结构及各部件功能 紫外可见分光光度计主要有光源、单色器、样品室、光电转换器及显示器五部分组成(图2)。3.1.1光源光源:(

16、1)功能： 其作用是仪器提供合适的光源，较为理想的光源应具备以下功能：a.在所用的波长范围内能提供连续的辐射,即光源应发射连续光谱b.辐射能随波长的变化尽可能小,且有足够的强度c.具有良好的稳定性， d.使用寿命要长(2)类型： a. 紫外光源： 氢灯(190-360nm) 氘灯(180-500nm) 汞灯(200-700nm) b. 可见光源： 钨灯(320-3200nm) 碘钨灯(240-1200nm) 钠灯(400-1000nm)3.1.2单色器单色器:(1).功能功能： 单色器是将混合光源分成单色光,它由单色器和狭逢两部分组成(2).类型类型： a.滤光片单色器滤光片单色器: 滤光片单

17、色器是最简单,最廉价的单色器, 常在光电比色计中使用, 在分光光度计只是用来消除单色器的杂散光或用来校正波长.b.棱镜单色器棱镜单色器: 光学玻璃棱镜(可用于可见红外分光)石英玻璃棱镜(可用于紫外可见红外分光)人造蓝宝石棱镜(可用于紫外可见红外分光)c.光栅单色器光栅单色器:透射光栅透射光栅:在玻璃或其它透明材料刻制平行线反射光栅反射光栅:在抛物线玻璃或镀铝金属表面刻制平行线全息光栅全息光栅:根据双光束干涉的原理制成的干涉条纹 全息光栅刻制方法是利用激光器照射出的两束相关光源,照射到涂成有抗腐蚀层的毛坯上,是干涉条纹层像在抗腐蚀层上,再用适当的化学容剂除去被照射的部分(显影),从而腐蚀层产生一

18、定空间 结构的干涉条纹,这种方法刻制的条纹最多可达4000/mm. 光栅单色器的性能优劣决定于光栅的材料和该材料单位面积上刻的条纹的数目,刻的数目越多分辨率越高(一般是1200条/cm,较好的 6000条/cm).3.1.3狭逢狭逢： (1). 功能：狭逢是单色器的重要组成部分,直接关系到仪器的分辨率,它是由两块锋利金属刀片组成,两刀片之间是严格平行的, 其主要作用是将来自单色器的散射光切割成单色光。 (2).类型类型： a. 入射狭逢：狭逢的位置设置在光源和单色器之间 b. 出射狭逢：狭逢的位置设置在单色器和比色池之间(3).狭逢的表示方法：狭逢的表示方法： a.以狭逢的实际宽度来表示,单位

19、是mm b.以出射狭逢所能透过的光谱宽度来表示, 单位是nm (4).狭逢的形状狭逢的形状 a.长方形,是由两块平行刀片组成 b.弧形, 是由两块弧形刀片组成3.1.4样品室样品室:(1)功能：功能：样品池由样品架、保温池、比色池三部分组成，其功能是使光和样液发生作用,产生辐射信号变化(2).样品架样品架： 单孔、四孔、六孔、微孔、 胶孔(3)保温池保温池：电子保温池、循环水保温池(4)比色池比色池： 光学玻璃、有机玻璃、石英玻璃、蓝宝石等材料制成 3.1.5光电转换器光电转换器(检测器检测器)：(1)功能：功能：是将光信号转变成电信号，再通过换大器将信号输送给显示系统(2)类型：类型：a.光

20、电池光电池: 硒光电池: 仅限于可见光范围,最灵敏的波长范围在500-600nm 硫化铅光电池: 可以用于紫外-可见-红外波长范围,但灵敏度较差.b.光电管光电管: 光电管是由密封在玻璃管或石英玻璃管内的两个金属电极组成,常用的有蓝敏和红敏两种,蓝敏是在镍阴极表面镀锑和铯,适用于210-625nm的波长范围,红敏是在镍阴极表面镀银和氧化铯,适用于625-1000nm的波长范围 充气光电管充气光电管:在光的照射下,由于阴极发出的电子与管内的气体分子发生碰撞,导致气体分子电离释放出二次电子而产生较大的电流,光照强度与电流大小成正比. 但充气光电管的线性关系较差. 真空光电管真空光电管: 在光的照射

21、下阴极发出的电子在真空管内向阳极高速运动而产生电流. 光照强度与电流大小成正比. 真空光电管的线性关系较好. (图3) c.光电倍增管光电倍增管: 光电倍增管产生光电流的基本原理同光电管一样,所不同的是在光电管的阴极和阳极之间增加了若干个倍增电极.当光照射时,各 电极都产生电压,阴极的电位最低,各倍增电极的电位依次增加,阳极的电位最高(图4).d.光电二极管矩阵光电二极管矩阵(photodiode array) 光电二极管矩阵是由很多二极管并联而成的, 光电二极管的数目多少决定了仪器的分辨率, 光电二极管的数目越多, 仪器的分辨率越高.通常由数十到数百个光电二极管组成. 3.1.6显示器显示器

22、:(1)功能：是将获得的电信号转变成图形数字,以一定的方式显示出来。(2)类型： 指针式显示 LD数字显示 VGA屏幕显示 计算机显示3.2紫外分光光度计的分类与技术指标紫外分光光度计的分类与技术指标3.2.1紫外分光光度计的分类紫外分光光度计的分类(1)按仪器使用的波长分类a.真空紫外分光光度计(0.1-200nm)b.可见分光光度计(350-700nm)c.紫外可见分光光度计(185-900nm)d.紫外可见-红外分光光度计(185-2500nm)(2).按仪器使用的光学系统分类按仪器使用的光学系统分类a.单光束分光光度计b.双光束分光光度计c.双波长分光光度计d.双波长双光束分光光度计e

23、.动力学分光光度计4.光谱分析的方法光谱分析的方法4.1 定性分析定性分析 利用测定某些未知物的一些理化性质与已知化合物的理化性质比较,从而确定未知物是何种化合物,称为定性鉴定. 在做定性鉴定时,要注意以下几点(1)溶剂:对标准物和被测物有良好的溶解度,本身在测定的波长内无光吸收(2)在同样的条件下(如溶剂,pH,离子强度,温度,及所用的仪器)测定标准物和待测物的吸收光谱(3)同时改变测定条件, 标准物和待测物的吸收光谱仍然完全相同4.2 纯度鉴定纯度鉴定 一种纯物质在紫外区有其特征吸收光谱,如核酸在260nm,蛋白质在280nm 纯核酸的标准光吸收比为 280/260 = 0.5 纯蛋白的标

24、准光吸收比为 280/260 = 1.8 采用紫外吸收光谱测定样品的纯度即方便又灵敏,测得结果可靠.4.3定量分析定量分析 分光光度法定量分析的基本原理与比色法相同,符合光吸收定律,分析的方法有:(1).单组分的定量分析单组分的定量分析 测定单组分的样品,首先测出该样品的吸收光谱曲线,找到其max,然后,用此波长作比色分析.用分光光度法作定量分析有两个优点 a.入射光的单色性好,最大吸收峰波长准确,灵敏度高,受干扰因素少. b.即可测定有色物质含量,又可测定无色物质的含量(2).多组分混合物的定量定量测定多组分混合物的定量定量测定 含有一种以上的多组分样品,可根据各组分的吸收光谱曲线作定量分析, 混合样品的定量分析大致可分两类:a. 吸收光谱不重叠的混合定量测定吸收光谱不重叠的混合定量测定 在被测样品中存在着两种或两种以上的物质, 但它们的吸收光谱不互相重叠,可根据各自的最大吸收峰来测定