活体细胞溶酶体膜通透性完整性吖啶橙荧光检测试

1、个人资料整理，仅供个人学习使用活体细胞溶酶体膜通透性(LMP ) /完整性吖啶橙荧光检测试剂盒产品说明书(中文版) 主要用途活体细胞溶酶体膜通透性(LMP ) /完整性吖啶橙荧光检测试剂是一种旨在通过吖啶橙吸收和细胞内再分布检测技术， 选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色， 即存在于或由溶酶体释 放到细胞浆的荧光染料的不同荧光强度变化， 来分析和观察溶酶体膜通透性的权威而经典的 技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞溶酶体(动物、 人体、昆虫等)膜通透性的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简 捷，性能稳定。 矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。技术背景溶酶体

2、(lysosome)是一种动态性的、多态性的、含有水解酶的细胞器，具有接受和降解来自于分泌性、内吞性(endocytic)、自噬性(autophagic)、吞噬性(phagocytic)膜运转通路 中的大分子。 其功能是膜依赖性， 具有解毒和防御作用。 溶酶体膜是溶酶体内基质和胞浆之 间的生理屏障， 为整合性糖蛋白， 防止细胞自我降解。 一旦溶酶体膜去稳定 ( destabilization )， 例如碱性化或内容物移位( translocation )，将导致质子和水解酶外漏，而造成细胞器功能异 常，进而产生细胞坏死、凋亡，以及病理症状，例如朊病毒脑病(prion encephalopath

3、ies)、阿茨罕默病、 心肌缺血、 脊髓灰质炎病 毒感染、 补体 激活型肺损伤( complement activation-produced lung injury ) 、急性组织损伤等疾病。其中膜通透性增加，是溶酶体膜去 稳定性或去完整性的标志之一， 溶酶体内容物大量释放到胞浆中， 直接影响细胞的存活。 吖 啶橙(acridine orange ； AO )是一种亲溶酶体(lysomotropic )异染性(metachromatic)的荧 光染料，在完整的溶酶体内，为质子化( protonated)寡聚体(oligomeric )形式，呈现红色 荧光(激发波长 555nm,散发波长617

4、nm)，而在胞浆内，为单体去质子化形式，呈现绿色 荧光(激发波长 490nm，散发波长528nm)。吖啶橙进入溶酶体后重新分布，即吸收和细胞 内再分布( uptakeand redistribution ),用于分析溶酶体膜通透性状况。 聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測。 产品内容清理液(Reage nt A)毫升染色液(Reage nt B)微升产品说明书 1 份保存方式保存染色液(Reage nt B)在20C冰箱里，避免光照；其余的保存在4 C冰箱里；有效保证6月用户自备24 孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器1.5 毫升离心管：用于细胞染色的容器 微型台式离心机：用于沉淀细胞 培养箱：用于染

5、色孵育(共聚焦)荧光显微镜：用于细胞荧光分析 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析 细胞流式仪：用于细胞荧光分析实验步骤贴壁细胞染色准备 1 个细胞培养 24 孔板的待测细胞(注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和其它培养孔板，见注意事项8)残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骒。小心抽去细胞培养液个人资料整理，仅供个人学习使用小心沿着孔壁加入 XX微升37C预热的清理液（Reage nt A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔 表面小心抽去清理液小心沿着孔壁加入 xx微升染色液（Reage nt B）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面放进37 C细胞培养箱里孵育 15分钟，避免光照

6、小心抽去染色液（ Reagent B）小心沿着孔壁加入 xx微升37C预热的清理液（Reage nt A）到细胞培养孔 小心抽去清理液重复实验步骤 8 和 9 一次小心沿着孔壁加入 xx微升37C预热的清理液（Reage nt A）到细胞培养孔 选择下列方式之一进行操作：（ A ）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测） ：激发波长490nm,散发波长528n绿色荧光增强，表明膜通透性（LMP ）增强激发波长555nm,散发波长617n红色荧光减弱，表明膜通透性（LMP ）增强使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测） ：激发波长490nm,散发波长528nRFU升高，表明膜通透性（LMP ）增

7、强激发波长555nm,散发波长617nRFU 降低，表明膜通透性（LMP ）增强悬浮细胞或脱离细胞染色将悬浮细胞或脱离细胞（ 1 X 106 细胞）移入到 1.5 毫升离心管放进微型台式离心机离心5分钟，速度为 300g （或2000RPM，例如eppendof 5415）小心抽去上清液加入xx微升37C预热的清理液（Reage nt A）,混匀细胞颗粒群放进微型台式离心机离心5分钟，速度为 300g （或2000RPM，例如eppendof 5415）小心抽去上清液加入xx微升37C预热的清理液（Reage nt A）,混匀细胞颗粒群加入xx微升含有染色液（Reage nt B）,充分混匀放

8、进37 C细胞培养箱里孵育 15分钟，避免光照放进微型台式离心机离心5分钟，速度为 300g （或2000RPM，例如eppendof 5415）小心抽去上清液加入xx微升37C预热的清理液（Reage nt A）,混匀细胞颗粒群放进微型台式离心机离心5分钟，速度为 300g （或2000RPM，例如eppendof 5415）小心抽去上清液重复实验步骤 12 至 14 一次加入xx微升37C预热的清理液（Reage nt A）,混匀细胞颗粒群选择下列方式之一进行操作：进行细胞流式仪分析：FL1 （激发波长488nm ,散发波长528nm）,或FL3 （激发波长555nm , 散发波长617n

9、m）观察10000个细胞以上 酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭。FL1 :波峰右移，表明膜通透性（LMP ）增强FL3 :波峰左移，表明膜通透性（LMP ）增强 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测） ：1）移取 10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片激发波长490nm,散发波长528n绿色荧光增强，表明膜通透性（LMP ）增强激发波长555nm,散发波长617n红色荧光减弱，表明膜通透性（LMP ）增强或使用荧光分光光度仪检测（定量检测） ：个人资料整理，仅供个人学习使用1）移取500微升上述细胞悬液到 1毫升比色杯2）加入xx微升清理液（Reage nt A）3）上下倾倒混匀数次4）放进荧

10、光分光光度仪：激发波长490nm，散发波长528nRFU升高，表明膜通透性（LMP ）增强激发波长555nm，散发波长617nRFU 降低，表明膜通透性（LMP ）增强注意事项本产品为20次（0.5毫升体系/次）操作操作时，须戴手套操作时，避免污染母液建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析孵育时，必须避免光照本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板,须相应调整处理液：彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔。操作容器建议操作体系载玻片100微升载玻片培养皿1毫升35mm培养皿1毫升96孔培养板100微升48孔培养板200微升24孔培养板500微升12孔培养板1毫升6孔培养板2毫升25cm2细胞培养瓶3毫升可以使用绿色荧光中激发波长