药物分析抗生素类药物分析ppt课件

1、第十一章第十一章 抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析一、概述一、概述1.抗生素抗生素antibiotics： 在低微浓度下即可对某些生物病原在低微浓度下即可对某些生物病原微生物的生命活动有特异抑制造用的微生物的生命活动有特异抑制造用的化学物质的总称化学物质的总称2.分类分类内酰胺类内酰胺类氨基糖苷类氨基糖苷类四环素类四环素类大环内酯类大环内酯类多烯大环类多烯大环类多肽类多肽类3.来源：来源： 生物合成发酵生物合成发酵 化学合成或半合成化学合成或半合成4.抗生素的特点：抗生素的特点： 化学纯度较低化学纯度较低 活性组分易发生变异活性组分易发生变异 稳定性差稳定性差消费工艺复杂消费工艺复杂发酵过

2、程不易控发酵过程不易控制易受污染制易受污染5.抗生素质量分析抗生素质量分析采用生物学法与物理化学法采用生物学法与物理化学法鉴别：理化方法、微生物法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、检查：水分、pH值、异常毒性、热原、值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等细菌内毒素、降压物质等含量含量/效价测定：效价测定： 微生物法微生物法 ： 与临床疗效吻合与临床疗效吻合,灵敏度灵敏度高；但操作复杂费时高；但操作复杂费时 理化方法：准确度与专属性较高理化方法：准确度与专属性较高, 且操且操作简便；但与临床疗效有偏向作简便；但与临床疗效有偏向二、二、 内酰胺类内酰胺类包括青霉素类和头孢菌素类包括青霉素类和

3、头孢菌素类1.化学构造：化学构造：青霉素类：青霉素类：6-APA为母核为母核头孢菌素类：头孢菌素类：7-ACA为母核为母核*2. 主要理化性质：主要理化性质：1酸性羧基：酸性羧基： pKa 2.5-2.8 酸性较强酸性较强 与碱金属成盐后水溶性好与碱金属成盐后水溶性好2 UV共轭：共轭： 青霉素类：苯环取代基青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭构造头孢菌素类：母核有共轭构造3旋光性：旋光性： 有多个手性碳有多个手性碳4稳定性内酰胺：稳定性内酰胺： 枯燥条件较稳定，溶液不稳定枯燥条件较稳定，溶液不稳定 青霉素青霉素 降解、失效降解、失效氧化剂、酸、碱氧化剂、酸、碱酶、金属离子、酶、金属离

4、子、3. 鉴别鉴别1羟肟酸铁反响：羟肟酸铁反响：内酰胺类内酰胺类 羟肟酸羟肟酸 显色显色2茚三酮反响茚三酮反响-氨基氨基 蓝紫色蓝紫色3双缩脲反响双缩脲反响内酰胺类内酰胺类 紫色紫色4光谱法光谱法UV、NMR5色谱法色谱法HPLC、TLCNH2OHHClNaOHFe3+H+茚三酮茚三酮 碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜呈呈色色反反响响取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示3.8 附近 6.97.5 7.99.0 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2 ： 3 ： 5强度比强度比头孢氨苄鉴别的TLC条件ChP(2000) 5mg/ml 2l 硅胶G 0.1mol/L枸橼酸液-0.2m

5、ol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)；0.1%茚三酮溶液显色USP(24) 25mg/ml 5l 硅胶 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)；短波长UV光检出BP(2019) 0.4%(W/V) 1l 硅烷化硅胶HF254 15.4% NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)；254nm检出4.特殊杂质检查特殊杂质检查聚合物、有关物质、异构体等聚合物、有关物质、异构体等头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定色谱条件与系统适用性实验色谱条件与系统适用性实验 用葡聚糖凝胶用葡聚糖凝胶G-1040120m为填充剂，玻璃柱内径为填充剂，玻璃柱内径1.31.5cm，床

6、体积，床体积5060ml；流动相；流动相A为含为含3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.01mol/L磷酸磷酸盐缓冲液取磷酸氢二钠盐缓冲液取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠和磷酸二氢钠0.54g，加，加水水1000ml使溶解，调理使溶解，调理pH至至7.0，流动相，流动相B为为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1ml；检测波长为；检测波长为254nm。以流动相。以流动相A为流动相，用为流动相，用1mg/ml蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖2000溶液进样溶液进样200l进展测定，实际板数应不低于进展测定，实际板数应不低于900，拖尾因子在拖尾因子在0.751.5，对照品溶液以

7、流动相，对照品溶液以流动相B为流动相，为流动相，反复进样反复进样200l，峰面积值的相对规范差应小于，峰面积值的相对规范差应小于5.0%对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精细称定，加水制成每细称定，加水制成每1ml中含头孢他啶中含头孢他啶100g的溶液，摇匀的溶液，摇匀测定法测定法 取本品适量，精细称定，加水制成每取本品适量，精细称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶中约含头孢他啶20mg的溶液，立刻进样的溶液，立刻进样200l，以流动相以流动相A为流动相进展测定，记录色谱图；为流动相进展测定，记录色谱图；另取对照品溶液另取对照品溶液200l注入液

8、相色谱仪，以流注入液相色谱仪，以流动相动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 色谱条件与系统适用性实验：测定头孢呋色谱条件与系统适用性实验：测定头孢呋辛酯的辛酯的HPLC系统为系统为ODS分析柱；分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵-甲醇甲醇62:?38为流动相，流为流动相，流速速1ml/min；检测波长；检测波长278 nm。要求头孢呋。要求头孢呋辛酯辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯异构体之间，

9、头孢呋辛酯A异构异构体与头孢呋辛酯体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分别度异构体之间的分别度应大于应大于1.5；实际板数按头孢呋辛酯；实际板数按头孢呋辛酯A异构异构体峰计算，应不低于体峰计算，应不低于1500异构体异构体 取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的甲醇-流动相(11)的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保管时间约为0.85，A异构体峰的相对保管时间为1.0。供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。 40020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401 有关物质有关物

10、质 取本品适量，精细称定，加流动相制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；精细量取适量，加流动相制成每1ml中约含6g的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调理仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保管时间的2.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积5.含量测定含量测定1碘量法碘量法ChP2000原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反响，原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反响，但其碱性降解产物可耗费碘但其碱性降解产物可耗费碘青霉素族头孢菌素族NaOH水

11、解4I2H +8I-I2+2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6定量过量定量过量剩余剩余 反响分两步进展：反响分两步进展： 水解反响水解反响 ( (按化学计算量进展按化学计算量进展) ) 氧化氧化- -复原反响复原反响 ( (无定量关系，受温度、无定量关系，受温度、pHpH值和时间等要素影响，应严厉控制反响条件值和时间等要素影响，应严厉控制反响条件并采用规范品平行对照测定并采用规范品平行对照测定) )空白实验空白实验因样品中杂质会耗费碘，故应作空白因样品中杂质会耗费碘，故应作空白实验实验 空白实验与经典空白实验不同：空白实验与经典空白实验不同：参与样品，不加碱，其他试剂醋酸参与样品，不

12、加碱，其他试剂醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠都加盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠都加实验条件：实验条件：I2氧化氧化弱酸性弱酸性pH4.5 碱碱 I2 IO3- + I- 酸酸 某些药物与碘生成复盐沉某些药物与碘生成复盐沉淀淀 温度温度2426 温度温度38 时未水时未水解的供试品亦耗费碘解的供试品亦耗费碘反响时间：反响时间： 20分分钟钟20分钟后，耗碘量分钟后，耗碘量随时间的变化较小随时间的变化较小特点特点灵敏度高：样品灵敏度高：样品 : 碘碘 = 1 : 8反响条件、实验操作要求高反响条件、实验操作要求高含量含量1 1份含量份含量V对、对、V对空对空V样、样、V样空样空加试剂次序、反响时间、滴

13、定速度一样加试剂次序、反响时间、滴定速度一样含量含量 对照品对照品 V样空样空 - V样样 W对对 V对空对空 - V对对 W样样2电位配位滴定法汞量法电位配位滴定法汞量法 原理：青霉素不与汞盐反响，其碱性降解产原理：青霉素不与汞盐反响，其碱性降解产物可与物可与Hg2+络和络和 Hg+ + 2R-SH (RS)2Hg + 2H+ Hg2+OOHHRHHCNCCCSCONHCHCCOOHCH3CH3ROHHHCSCONHCCOOHCH3CH3HNCHg2+OHHCHCONHHOOCROCSCH3CH3CNHHg2+O方法阐明：方法阐明： a 空白实验与碘量法类似，加样品，不加空白实验与碘量法类似

14、，加样品，不加NaOH b 与碘量法相比，汞量法不需对照实验与碘量法相比，汞量法不需对照实验3酸碱滴定法酸碱滴定法4硫醇汞盐法硫醇汞盐法 青霉素青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐青霉烯酸硫醇汞盐5羟肟酸比色法羟肟酸比色法 内酰胺类内酰胺类 红色红色6HPLC法：运用广泛法：运用广泛咪唑HgCl2max 324345nmNH2OHH+Fe3+阿莫西林克拉维酸钾片阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性实验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调理pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相

15、；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分别度应大于3.5 测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精细量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。三、氨基糖苷类三、氨基糖苷类1.化学构造化学构造链霉素链霉素 都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷都是以氨

16、基环醇与氨基糖缩合而成的苷 分子构造中都含有多羟基分子构造中都含有多羟基 均为碱性抗生素均为碱性抗生素2.性质性质1碱性氨基：临床运用其硫酸盐碱性氨基：临床运用其硫酸盐2溶解度氨基、羟基：水溶性溶解度氨基、羟基：水溶性3旋光性糖：多个手性碳旋光性糖：多个手性碳4稳定性苷：强酸、碱条件均可水解稳定性苷：强酸、碱条件均可水解3.鉴别鉴别1茚三酮反响：茚三酮反响： 具羟基胺类具羟基胺类,-氨基酸性氨基酸性质质 链霉素链霉素 + 水和茚三酮水和茚三酮 蓝紫色蓝紫色2 N-甲基葡萄糖胺甲基葡萄糖胺Elson-Morgan反响：反响： 链霉素链霉素 N-甲基葡萄糖胺甲基葡萄糖胺 红色红色水解对二甲氨基苯甲

17、醛乙酰丙酮OH-NCHONCH3CH3+CH3CH3NCNHCH3CH3HNNCH+H+3 3麦芽酚麦芽酚Maltol)Maltol)反响反响 ( (链霉糖特有链霉糖特有 链霉素链霉素 麦芽酚麦芽酚 紫红色紫红色OH-重排Fe3+Fe/3OOCH3OOOCH3OH8-羟基喹啉 NaOBr或-萘酚 OH-水解4坂口坂口Sakaguchi反响：反响： (链霉胍特有链霉胍特有 链霉素链霉素 链霉胍链霉胍 橙红橙红5硫酸盐反响硫酸盐反响4. 检查检查1链霉素中链霉素链霉素中链霉素B的检查的检查 来源：发酵中产生来源：发酵中产生 BP：薄层色谱法杂质对照品法：薄层色谱法杂质对照品法2庆大霉素庆大霉素C

18、组分测定组分测定 系统适用性实验系统适用性实验 色谱柱：色谱柱：ODS 流动相：流动相：H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸配制的庚烷磺酸钠溶液钠溶液(0.2M)，必要时调理甲醇的含量，必要时调理甲醇的含量 检测波长：检测波长：330nm邻苯二甲醛柱前衍生邻苯二甲醛柱前衍生 要求：要求：NC2 2000，C2a峰和峰和C2峰的分别度峰的分别度应符合要求，反复进样应符合要求，反复进样RSD2.0%5. 含量含量 微生物法、微生物法、HPLC法等法等四、四环素类四、四环素类1.化学构造化学构造2.性质性质1两性：两性： -OH：酸性：酸性 N(CH3)2：碱性：碱性 与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐2旋光性旋光性3UV和荧光：和荧光： 4与金属离子络合：与金属离子络合： 酚羟基、烯醇基与酚羟基、烯醇基与Ca2+、Mg2+络合显色络合显色5稳定性稳定性 易发生异构化易发生异构化,降解等反响降解等反响,性质不稳定性质不稳定弱酸性弱酸性pH2-6 A环环C-4异构化异构化 差向四环素差向四环