叶部病害分离

1、柯氏准则：柯氏准则：1. 这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往往就有这种微生物的存在；往就有这种微生物的存在；2. 从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可以在各种培养基上研究它的性状；以在各种培养基上研究它的性状；3. 将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发与原来相将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发与原来相同的病害；同的病害；4. 从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。一、实验目的一、实验目的1. 为了证实其病原菌的特性；2.

2、为了进一步研究病原菌的形态、生活史、生理和生态特性；3. 为了获得其发酵液等 鉴于以上原因，分离和纯化真菌是必需的，是保证整个实验能够顺利进行的前提。二、实验原理二、实验原理 真菌的分离就是将所需要的真菌与其他杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。 为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯培养菌株。三、实验步骤三、实验步骤1. 分离前的准备工作（1）工作台的灭菌（2）培养基的准备（3）操作人员的清洁（4）分离所需用具

3、的消毒与灭菌 培养皿、小烧杯、接种针、酒精灯、解剖刀、剪刀、纱布、记号笔、镊子、酒精、培养基、 表面消毒液2. 分离材料的选择分离材料的选择（1）必需是新鲜发病的植株、器官或组织（2）选择的组织必需是病健交界的部位 原因：主要是尽量减少腐生菌的污染3. 组织的表面消毒组织的表面消毒（1）升汞溶液：一般用0.1的升汞溶液；升汞表面消毒所需 的时间因材料不同，处理的时间可自30s30min不等，通常为35min。（现在不用）（2）次氯酸钠：所用的浓度一般每一次使用的是35的水溶液，消毒时间为515min。（3）酒精：常用浓度70酒精。消毒时间一般很短，只有几秒钟至1min。4. 一般分离方法一般分

4、离方法 病原真菌种类繁多，其分离的方法不同，而同一种材料又可用不同的方法分离。常用的方法可分为两大类，即组织分离和稀释分离法。（1）组织分离法）组织分离法 植物病原真菌（尤其是叶部病害）的分离一般都是用组织分离法，即就是切取小块病组织，经表面消毒和无菌水洗过之后，移在培养基平板上培养。注意事项： 组织大小要适宜，一般为45mm的小块。 切取的组织块必需是病健交界的部位。 要掌握消毒时间的长短。（2）稀释分离法）稀释分离法 植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分离，但对于一些产孢子量极大的病原真菌和霉菌，可以配制成孢子悬浮液进行稀释分离。 具体步骤：将寄主组织受害部分的孢子洗下配成悬浮液，经稀释后

5、与熔化并冷却到45度左右的培养基混合，然后倒在灭菌的培养皿中。注意事项： 待分离组织必需是新鲜发病的。 要掌握培养基的温度。 要掌握孢子悬浮液的浓度。（3）细菌污染的排除）细菌污染的排除 在分离过程中，由于细菌生长繁殖速度快于真菌，是获得病原真菌纯培在分离过程中，由于细菌生长繁殖速度快于真菌，是获得病原真菌纯培养最大的障碍。因此，在分离过程中，常采用一些方法来抑制细菌的生长，养最大的障碍。因此，在分离过程中，常采用一些方法来抑制细菌的生长，从而保证能够获得目的菌株。从而保证能够获得目的菌株。 将培养基调节到酸性反应，在将培养基调节到酸性反应，在100mL培养基中加培养基中加3滴滴25的乳酸。的

6、乳酸。 培养基中加入适当的抗菌素，以抑制细菌的生长。培养基中加入适当的抗菌素，以抑制细菌的生长。常用的抗菌素：常用的抗菌素：金霉素：浓度为金霉素：浓度为30g/mL，可以抑制多数细菌的生长；，可以抑制多数细菌的生长；青霉素：浓度为青霉素：浓度为20g/mL，可以抑制革兰氏反应阳性细菌的生长；，可以抑制革兰氏反应阳性细菌的生长；多粘霉素：多粘霉素： 浓度为浓度为5g/mL，可以抑制革兰氏反应阴性细菌的生长；，可以抑制革兰氏反应阴性细菌的生长；链霉素：浓度为链霉素：浓度为40g/mL，可以抑制大部分细菌的生长；，可以抑制大部分细菌的生长；氯霉素：浓度为氯霉素：浓度为50g/mL，可以抑制大部分细菌

7、的生长。，可以抑制大部分细菌的生长。使用方法：除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后使用方法：除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后并冷却至并冷却至45左右时加入。左右时加入。 双层培养基法双层培养基法真菌菌丝体能够穿透培养基，而细菌则没有这种能力。真菌菌丝体能够穿透培养基，而细菌则没有这种能力。5. 真菌培养性状的观察真菌培养性状的观察 培养真菌的目的主要是观察它的性状；研究环境条件对它的影响；了解其生理生化特性。（1）培养性状的观察：观察和描述真菌的性状最好是培养在琼胶培养基上。观察和记载的项目主要是： 菌落的质地； 菌落形成是凸起的或者是有成簇的菌丝体

8、； 形成成堆的孢子是干的还是粘性的； 各种子实体和休眠结构的形成和所需的时间； 菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培养基中； 有无特殊气味； 菌落中有没有部分呈扇状； 生长率的快慢。注意事项： 培养性状的观察与描述需要不断的观察，有一定的时间延续性； 最好选用多种培养基； 培养性状的描述要注明培养基的种类、培养温度和有无光照等。（2）生长量的测定）生长量的测定为了研究真菌的营养要求和环境影响，必需知道他们的生长率。在一定时间内菌丝体增长的量，就是在这段时间内的平均长率。真菌和其他微生物生长量与培养时间表现了特定的关系，如果测量的次数较多，就能得到一个平滑的曲线，曲线的倾斜度就是真菌菌丝的生长率

9、。真菌菌丝体的生长量，可以用直接和间接的方法进行测定。直接测定的方法有以下几种： 目力估测优点：快速；缺点：精确度低。 直线生长优点：能够进行多次测量，精确表明菌丝生长率；缺点：测量的次数过多，容易造成培养菌的污染。 湿重测定优点：快，并且菌丝是未经处理而保持其原来的状态；缺点：精确度低，只能测定一次，不能体现其延续性。 干重测定优点：比较精确；缺点：同上。间接测定方法有很多种，比如：全氮量和核酸分析，干菌丝体含氮量是4.58.5，DNA 0.40.8。此外，可以通过分析培养液中糖的含量的变化，来间接证明菌丝的生长量。7. 真菌菌种的保存真菌菌种的保存分离到的真菌要用适当的保存方法，以保持它的

10、生活力和原有的性状，并避免其他杂菌和螨类的污染。保存的菌种要注明菌种的种、菌系和保存日期。真菌菌种的常用保存方法如下：（1）室温保存）室温保存温度在1617，相对湿度60左右；每隔36个月需要移植一次；存在问题： 保存大量的菌种时，定期移植不但工作量大和可能引起性状的变化，而且容易发生差错和污染。 在长期培养和保存过程中，有些真菌可能退化。（2）低温保存）低温保存 常规方法：温度48度的冰箱中，每68个月需要移植一次； 有些生活力差的真菌，存放在-20度的低温冰箱中效果最好； 近年来受到重视的是超低温保存法，降菌种通过特殊的处理后，放入-70-80度的低温环境中。（3）矿物油保存）矿物油保存

11、使用最广的方法，多数真菌可以用此种方法保存，有的存活期可以达到10年。 矿物油要用质量好的医用石蜡油，用高压灭菌在120度下灭菌2h，或在170度条件下干热灭菌12h。然后将石蜡油加在长好的菌丝表面，厚度为1cm，在室温下保存。 一般情况下，每隔23年，检查菌种的存活情况。（4）土壤中保存）土壤中保存 一般用于产孢的真菌。 有两种方法：一种方法是将孢子悬浮液加在试管中灭菌的土壤中，任其干燥后保存，或将干的真菌孢子与试管中灭菌的干土壤混合后保存；另一种方法是试管中放5g含水量70的土壤，灭菌后加1ml的孢子悬浮液，在适温下培养10d后保存。 土壤保存的菌种，一般都是放在冰箱中。（5）干燥保存）干燥保存 将干燥以后的真菌孢子和菌丝体，可以与干燥的砂、土壤或硅胶等混合，抽真空后密封保存。（6）冷冻干燥保存）冷冻干燥保存 原理：使微生物快速冷冻，然后通过升华作用，水直接从冰化为蒸汽而将水分除去。在整个过程中，微生物不是悬浮在液体中，因而能够保持原来的结构而不受损害，这种