玉米晚报叶斑病菌的荧光标记(GFP和DsRed)

1、2021/8/61 报报 告告 人人 ：陈茂功：陈茂功 指导老师：周印富指导老师：周印富 教教 授授 王晓鸣王晓鸣 研究员研究员 林小虎林小虎 教授教授玉米弯孢叶斑病菌的荧光标记玉米弯孢叶斑病菌的荧光标记及其在玉米侵染过程研究及其在玉米侵染过程研究2021/8/6汇报内容汇报内容研究背景研究背景1农杆菌介导的新月弯孢转化农杆菌介导的新月弯孢转化2转化子插入突变分析转化子插入突变分析3新月弯孢对玉米侵染过程新月弯孢对玉米侵染过程4 玉米弯孢叶斑病抗病资源筛选玉米弯孢叶斑病抗病资源筛选5致谢致谢7全文结论全文结论62021/8/6一一.研究背景研究背景 玉米弯孢叶斑病（玉米弯孢叶斑病（Curvul

2、aria leaf spot），又称黑霉），又称黑霉病、拟眼斑病，在我国主要是由新月弯孢（病、拟眼斑病，在我国主要是由新月弯孢（Curvularia lunata（Wakker）Boed.）引起，是继玉米大斑病、小）引起，是继玉米大斑病、小斑病后又一主要叶部病害。斑病后又一主要叶部病害。2021/8/6在我国，上世纪在我国，上世纪70年代起偶有发生。至年代起偶有发生。至80年代，随着年代，随着气候变化和栽培制度变更，该病害逐步开始流行，相继蔓气候变化和栽培制度变更，该病害逐步开始流行，相继蔓延到我国辽宁、北京、河北、河南、陕西、山东、吉林和延到我国辽宁、北京、河北、河南、陕西、山东、吉林和天津

3、等十余个省市。天津等十余个省市。叶片叶鞘茎苞叶2021/8/6弯孢叶斑病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶弯孢叶斑病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶部病斑密集成片，病株率及病叶率高达部病斑密集成片，病株率及病叶率高达100%。一般玉米减。一般玉米减产产20%30%，严重时减产，严重时减产50%以上，以上， 甚至绝收。甚至绝收。北京昌平严重弯孢菌叶斑病品种2021/8/6农杆菌T-DNA转化真菌机制示意图 目前农杆菌介导的遗传转化已经成功用于多种真菌的遗传目前农杆菌介导的遗传转化已经成功用于多种真菌的遗传转化，其中包括子囊菌纲（转化，其中包括子囊菌纲（48个种）、担子菌纲（个种）、担子菌纲

4、（8个种）、个种）、接合菌纲（接合菌纲（4个种）和卵菌纲（个种）和卵菌纲（3个种）。尤其那些传统方法个种）。尤其那些传统方法很难转化的，如长蠕孢霉、双孢蘑菇、玉米大斑病菌、玉米很难转化的，如长蠕孢霉、双孢蘑菇、玉米大斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌等。弯孢叶斑病菌等。2021/8/6 用于病原菌在植株中侵染用于病原菌在植株中侵染途径的研究途径的研究 用于植物病原菌及生防菌在用于植物病原菌及生防菌在植物根部的定殖研究植物根部的定殖研究 作为报告基因用于抗病转基作为报告基因用于抗病转基因植株的筛选因植株的筛选 用于病原菌致病基因表达活用于病原菌致病基因表达活力的研究力的研究普通显微镜观察荧光显微镜观察20

5、21/8/6抗性资源筛选方法：孢子悬浮液高压喷雾接种抗性资源筛选方法：孢子悬浮液高压喷雾接种 待玉米四叶期时，以接种液（待玉米四叶期时，以接种液（Tween20：0.02%；无菌水）调节；无菌水）调节分生孢子浓度至分生孢子浓度至1.0106个个/mL，用高压喷雾的方法接种于叶片。，用高压喷雾的方法接种于叶片。病级评价标准：病级评价标准： 1级级叶片上无病斑或病斑面积叶片上无病斑或病斑面积5%； 3级级少量病斑（少量病斑（610%）；）； 5级级叶片上病斑较多，占叶面积（叶片上病斑较多，占叶面积（11%30%）；）； 7级级叶片上有大量病斑，病斑相连，占叶面积（叶片上有大量病斑，病斑相连，占叶面

6、积（31%70%）；）； 9级级叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；2021/8/6 目前对该病害研究主要集中在抗病品种与病菌变异目前对该病害研究主要集中在抗病品种与病菌变异和致病机理等方面，但对该病菌在玉米叶片上的侵染及和致病机理等方面，但对该病菌在玉米叶片上的侵染及发育过程仍不十分清楚。发育过程仍不十分清楚。 运用荧光蛋白（绿色和红色）标记新月弯孢，通过运用荧光蛋白（绿色和红色）标记新月弯孢，通过生理生化等指标的筛选得到与野生菌相近的转化子，利生理生化等指标的筛选得到与野生菌相近的转化子，利用转化子观察新月弯孢在玉米叶部的侵染过程，分析新用转化子观察新月弯孢在玉米叶

7、部的侵染过程，分析新月弯孢在抗感玉米中侵染过程的差异。月弯孢在抗感玉米中侵染过程的差异。2021/8/62021/8/6二二.农杆菌介导的新月弯孢转化农杆菌介导的新月弯孢转化头孢噻肟钠对农杆菌抑菌浓度的测定潮霉素B对分生孢子萌发抑制浓度的测定05010015020005030751001502021/8/6共培养介质受体材料孢子萌发时间共培养温度和时间2021/8/6 当弯孢病菌分生孢子萌发当弯孢病菌分生孢子萌发12h后，在后，在25与农杆菌黑暗与农杆菌黑暗条件共培养条件共培养48h，共培养介质以微孔滤膜时转化效果最佳，共培养介质以微孔滤膜时转化效果最佳，转化效率可达到转化效率可达到100-1

8、10个转化子个转化子/106个孢子个孢子筛选用筛选用CM培养基所得到的转化子全为阳性，而以培养基所得到的转化子全为阳性，而以PDA为筛选培养基得到部分为假阳性；共培养时光照无影响。为筛选培养基得到部分为假阳性；共培养时光照无影响。转化子筛选菌落单孢分离2021/8/6gfp标记的新月弯孢DsRed标记的新月弯孢2021/8/66号对禾谷孢囊线虫的抗性遗传分析与基因定位M G1 G2 G3 G4 GFP R1 R2 R3 R4 DsRed ClhyggfpDsRed荧光标记的新月弯孢菌株中hyg基因、gfp基因和DsRed基因的PCR检测2021/8/66号对禾谷孢囊线虫的抗性遗传分析与基因定位

9、 2.34.69.4 23.0Cl G1 G2 G3 G4 R1 R2 R3 R4kbSouthern杂交结结果显示，大多数转化子为T-DNA单拷贝插入，且Southern杂交条带所处的位置各不相同，这说明T-DNA在基因组中的插入位点不同，没有明显的位点插入偏好。2021/8/66号对禾谷孢囊线虫的抗性遗传分析与基因定位转代四次后2021/8/6三三.转化子插入突变分析转化子插入突变分析R1 R2 R3 R4 G1 G2 G3 G4 Cl 转化子在CM培养基的菌落形态2021/8/6ABCDEFpH4.0pH5.5pH7.0pH8.5pH10.0pH11.52021/8/6转化子R4、G2与

10、野生菌株在PDA培养基的菌落直径测量酸性中性碱性2021/8/6产孢量纤维素降解酶果胶酶2021/8/6Cl R1 R2 R3 R4 G1 G2 G3 G4Cl R1 R2 R3 R4 G1 G2 G3 G4 CK转化子发酵液体培养基的滤液离体叶片针刺粗毒素后的病斑症状2021/8/6菌株编号ClR1R2R3R4G1G2G3G4CK病情指数59.652.330.510.759.453.458.233.556.70转化子粗毒素产生的离体叶片病斑面积转化子接种5 d后寄主的病情指数2021/8/6转化子长度(bp)MaxscoreMaxident基因注释登录序列号R 162710270%Pyren

11、ophora teres f. teres 0-1 hypothetical protein, mRNAXM_003295948.1R279048277%Pyrenophora tritici-repentis Pt-BFP ATP phosphoribosyltransferaseXM_001933274.1G152223181%Paracoccidioides brasiliensis Pb01 ATP phosphoribosyltransferase, mRNAXM_002788952.1G4112515786%Sclerotinia sclerotiorum 1980 hypothe

12、tical protein (SS1G_04048) partial mRNAXM_00159491.1侧翼序列基因的比对2021/8/6五五.新月弯孢对玉米侵染过程新月弯孢对玉米侵染过程G H IA B CD E FJ荧光显微镜下新月弯孢的侵染过程2021/8/62021/8/62021/8/6DEFGCBA扫描电镜下新月弯孢的侵染过程2021/8/6沈135(R) 黄早四(S) 0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 0h 6h 12h 24h 48h 72h 96hPALPR-1PR-10POX3LOXACT32021/8/6ABCD2021/8/6五五.玉米弯孢叶斑病抗病资

13、源筛选玉米弯孢叶斑病抗病资源筛选 对对441份玉米种质资源进行了抗弯孢叶斑病鉴定，份玉米种质资源进行了抗弯孢叶斑病鉴定，共筛选出表现高抗玉米材料共筛选出表现高抗玉米材料8份（京份（京05、选、选6、运、运42291、黄、黄5、赤黄、赤黄32、自、自3303、37、5003） ，高抗、抗、中，高抗、抗、中抗、感和高感的比例分别为抗、感和高感的比例分别为1.81%、12.01%、16.78%、55.34%和和14.06%。自交系中抗病的材料所占的比例。自交系中抗病的材料所占的比例小于地方的品种资源中抗病的材料所占的比例。小于地方的品种资源中抗病的材料所占的比例。2021/8/6全文结论全文结论v

14、通过农杆菌介导转化法成功将荧光蛋白基因（通过农杆菌介导转化法成功将荧光蛋白基因（gfp和和DsRed）转入新月弯孢基因组中，并优化了转化条件。）转入新月弯孢基因组中，并优化了转化条件。v 通过对转化子的致病性状（产孢量、细胞壁降解酶和通过对转化子的致病性状（产孢量、细胞壁降解酶和毒素）等分析筛选获得与野生型菌株差异最小的转化毒素）等分析筛选获得与野生型菌株差异最小的转化子子G2进行后续分析，进行后续分析，DsRed更易引起突变体的出现。更易引起突变体的出现。2021/8/6v亲和互作中，接种亲和互作中，接种2 h后分生孢子即可萌发，后分生孢子即可萌发，6 h分生分生孢子的萌发率可达到孢子的萌发

15、率可达到90%，2448 h能够观察到侵染丝能够观察到侵染丝从表皮直接侵入进寄主细胞。侵染丝在穿透寄主细胞从表皮直接侵入进寄主细胞。侵染丝在穿透寄主细胞壁时菌丝会有明显变细的现象；胞内菌丝形成后，细壁时菌丝会有明显变细的现象；胞内菌丝形成后，细胞变形成了空腔，后期时整个细胞塌陷坏死。胞变形成了空腔，后期时整个细胞塌陷坏死。 非亲和互作中，非亲和互作中， 48 h也能够观察到侵染丝从表皮侵入也能够观察到侵染丝从表皮侵入寄主，但侵染后菌丝在细胞间扩展慢；寄主，但侵染后菌丝在细胞间扩展慢；120 h时寄主产时寄主产生的病斑小且少。生的病斑小且少。2021/8/6v对抗感自交系间抗病因子的分析表明，发

16、现抗病相关对抗感自交系间抗病因子的分析表明，发现抗病相关基因在病原菌侵染基因在病原菌侵染1248 h转录水平升高，且抗病自交转录水平升高，且抗病自交系诱导表达时间早，表达量大，出现高峰时间也早。系诱导表达时间早，表达量大，出现高峰时间也早。抗病材料出现细胞凋亡时间较感病材料早，推测抗病抗病材料出现细胞凋亡时间较感病材料早，推测抗病材料早期细胞凋亡是寄主本身抗性的反应。材料早期细胞凋亡是寄主本身抗性的反应。v对对441份玉米种质资源进行了抗弯孢叶斑病鉴定，共筛份玉米种质资源进行了抗弯孢叶斑病鉴定，共筛选出表现高抗玉米材料选出表现高抗玉米材料8份。份。2021/8/6v本文主要探讨了新月弯孢与玉米间的互作，表明玉米抗本文主要探讨了新月弯孢与玉米间的互作，表明玉米抗感反应的重要环节主要在病原菌侵染的感反应的重要环节主要在病原菌侵染的1248 h1248 h；还筛；还筛选出了部分高抗弯孢叶斑病的玉米资源，为进一步研究选出了部分高抗弯孢叶斑病的玉米资源，为进一步研究玉米抗病弯孢基因提供资源和时间点参考。玉米抗病弯孢基因提供资源和时间点参考。2021/8/6致谢致