基因工程与体外表达

1、1第八章 基因工程与体外表达 Gene Engineering and Gene Expression 2目的要求目的要求 掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；质粒载体的特点；基因克隆的基掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；质粒载体的特点；基因克隆的基本过程。本过程。 了解：其他常用工具酶的特点。了解：其他常用工具酶的特点。 【重点】基因克隆的基本过程。【重点】基因克隆的基本过程。3 基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、

2、增强子等），以及研究基因的功能等。 4 第一节 基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。5 限制性核酸内切酶的特点类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点 型 有 有 特异 识别位点下游100到1000bp型 有 无 特异 可知、固定型 有 有 特异 识别位点附近切割DNA， 切割位点很难预测。62限制性内切酶的命名 EcoR E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株75 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G 3 CTTAA AATTC3 G5 5 53限

3、制性内切酶的识别和切割位点 通常是46个碱基对、具有回文序列（palindrome）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3黏性末端（sticky end）。 如EcoR切割后产生5黏性末端：8Pst切割后产生3黏性末端：有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如Sma：5 -CTGCAG-3 5 -CTGCA G-3 3 -GACGTC-5 3 -G ACGTC-5 5 -CCCGGG-3 5 -CCC GGG-3 3 -GGGCCC-5 3 -GGG CCC-5 9二、T4DNA连接酶（T4DNAligase）催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA

4、的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。10 第二节 基因克隆的载体 载体是携带目的基因，使其在宿主细胞内复制或表达的DNA分子。11一、常用的克隆载体(一)质粒（plasmid）是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。12作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。1314(二)噬菌体 野生型噬菌体经过改造，已衍生出100

5、多种克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。 15 gt10和gt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 gt11为表达型载体。16(三) M13噬菌体 (M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。1718(四)黏性质粒（cosmid） 是由噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达4050 kb。 19(五) 病毒载体 逆转录病毒、腺病

6、毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。20二、表达载体(一)原核表达载体表达载体中含有复制起始位点、抗性基因、克隆位点、启动子、核糖体结合位点和转录终止信号。21 multiple cloning site22(二)真核表达载体含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因.还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、转录终止信号和poly(A)加尾信号.23 第三节 基因克隆的基本过程基因克隆主要步骤：制备目的基因和选择相关载体目的基因和有关载体进行连接重组的DNA导入受体细胞D

7、NA重组体的筛选和鉴定DNA重组体的扩增、表达和其他研究24 （二）从cDNA文库中获得（三）PCR扩增特定基因（四）人工合成一、目的基因的获得 （一）从基因组文库中获得25几种常用克隆载体的比较注：+表示可用；-表示不可用比较内容 质 粒 噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组DNA文库 - + + -cDNA文库 + + - -亚克隆 + - - +序列分析 + + - +E.coli表达 + + - -二、载体的选择与准备26三、DNA分子的体外连接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接27（一）黏性末端

8、28（二）人工接头29（三）加入同聚体尾待克隆DNA片段重组质粒混合、退火空白质粒30（四）平端连接31四、外源DNA导入宿主细胞 （一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection） 32五、目的基因的筛选和鉴定 外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。33（一） 遗传学方法 插入灭活法1.342.蓝-白筛选（互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。

9、这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。353637（二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 38（三） 核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目

10、的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。39菌落原位杂交的原理 转化E. coli并铺于琼脂平板上将膜放置平板表面定位、揭起变性、中和、固定杂交、洗膜、显影40（四） PCR技术 具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。 41(五) 酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 422限制性内切酶的命名 EcoR E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株435 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G 3 CTTAA AATTC3 G5 5 53限制性内切酶的识别和切割位点 通常是46个碱基对、具有回文序列（palindrome）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3黏性末端（sticky end）。 如EcoR切割后产生5黏性末端：44 第二节 基因克隆的载体 载体是携带目的基因，使其在宿主细胞内复制或表达的DNA分子。4546(二)噬菌体 野生型噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。 目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和