基因工程与蛋白质工程

1、第十三章第十三章 基因工程与蛋白质工程基因工程与蛋白质工程一、基因工程的定义及主要内容一、基因工程的定义及主要内容二、重组二、重组DNADNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定分子引入宿主细胞和筛选鉴定三、克隆基因的表达三、克隆基因的表达四、基因工程的成就和展望四、基因工程的成就和展望五、蛋白质工程五、蛋白质工程一、基因工程定义及主要内容一、基因工程定义及主要内容 基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆 是指利用是指利用DNADNA重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种

2、以及开发特殊用途的微生物等 是生物工程的重要内容之一是生物工程的重要内容之一返回 主要步骤：主要步骤：1.1.带有目的基因的带有目的基因的DNADNA片段的获得片段的获得2 2、构建、构建DNADNA重组分子重组分子3 3、重组、重组DNADNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定分子引入宿主细胞和筛选鉴定4 4、基因的表达、基因的表达一、基因工程定义及主要内容一、基因工程定义及主要内容返回返回基因工程基本程序基因工程基本程序真核染色体真核染色体DNA克隆载体克隆载体（质粒）（质粒）限制酶切割限制酶切割限制酶切割并限制酶切割并分离所需片断分离所需片断重组载体重组载体细菌宿主细细菌宿主细胞的转化胞的转化细

3、胞分离细胞分离培养增值培养增值构建构建DNADNA重组分子重组分子 工具酶工具酶 目的基因的制备目的基因的制备 克隆载体克隆载体 DNADNA分子的体外重组分子的体外重组返回工具酶工具酶 限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶 DNADNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）、）、DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）、末端转移酶（）、末端转移酶（terminal terminal transferasetransferase）、逆转录酶（）、逆转录酶（reverse transcript

4、asereverse transcriptase）、核酸酶）、核酸酶S1S1（nuclease S1nuclease S1）和核酸外切酶）和核酸外切酶（exonucleaseexonuclease）返回限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 由由SmithSmith在在19701970年从流感噬血菌中发现年从流感噬血菌中发现 细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身DNADNA的特异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源的特异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源DNADNA相区别。这样，限制性核酸相区别

5、。这样，限制性核酸内切酶就能去切割破坏外源内切酶就能去切割破坏外源DNADNA，而对本身无影响。，而对本身无影响。 目前已从原核生物中分离出目前已从原核生物中分离出400400500500多种限制性核酸内切酶多种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 能识别能识别DNADNA特定核苷酸序列的核酸内切酶特定核苷酸序列的核酸内切酶分类分类: :三类三类. . 命名命名: :分布：主要来源于原核生物。分布：主要来源于原核生物。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点。切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）或平结果：产生黏性未端（碱基互

6、补配对）或平端。端。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性内切酶可识别限制性内切酶可识别4 4或或6 6个特异核苷酸序列个特异核苷酸序列 粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴，在断段产生一个短粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突伸出来的不齐末端。的单股突伸出来的不齐末端。 钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别序列的中心轴处，即产生平齐末端。钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别序列的

7、中心轴处，即产生平齐末端。返回限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 同裂酶:来源不同,但有相同的识别序列.或称异源同工酶. 同切点酶:不仅识别序列相同,而且切点也相同. 同尾酶:酶的识别序列不完全相同,但切出的粘性末端相同.几种限制性内切酶的作用位点几种限制性内切酶的作用位点返回几种限制性内切酶的作用位点几种限制性内切酶的作用位点返回目的基因的制备目的基因的制备 目的基因就是所需要克隆的外源基因 制备方法：1、人工合成法2、逆转录法3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离4、用PCR法扩增目的基因片段返回目的基因的制备：人工合成法目的基因的制备：人工合成法 较小分子基因可用人工化学合成的方法获得

8、较小分子基因可用人工化学合成的方法获得 DNADNA化学人工合成的方法已经自动化化学人工合成的方法已经自动化 人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的 缺点是：缺点是：1 1、不能合成太大的基因；、不能合成太大的基因；2 2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3 3、费、费用较高用较高返回目的基因的制备：逆转录法目的基因的制备：逆转录法 若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中

9、分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。 该法是：以编码某特异多肽的该法是：以编码某特异多肽的mRNAmRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNAmRNA的互补的互补DNADNA（cDNAcDNA）；）；再以再以cDNAcDNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶I I作用下，最终合成编码该多肽的双链作用下，最终合成编码该多肽的双链DNADNA（dsDNAdsDNA）。）。 可用于真核生物目的基因的获得可用于真核生物目的基因的获得返回目的基因的制备：逆转录法目的基因的制备：逆转录法返回返回目的基因的制备：目的基因的制备：逆转录法逆转录

10、法 用逆转录法合成用逆转录法合成cDNAcDNA的主要问题是：的主要问题是：1 1、mRNAmRNA必需提得很纯必需提得很纯2 2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物. .3 3、以单链、以单链cDNAcDNA为模板往往难以合成与单链为模板往往难以合成与单链cDNAcDNA一样长的一样长的dsdscDNAcDNA，这与实验技术有关。，这与实验技术有关。返回用限制酶切法直接从染色体用限制酶切法直接从染色体DNADNA中分离中分离 此方法主要适用于制备原核基因此方法主要适用于制备原核基因 对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出对于物理图谱已清

11、楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出来来 鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部DNADNA片段插入到片段插入到载体载体DNADNA（如（如pBR322pBR322）中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再）中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基因的需基因的DNADNA片段。片段。l 基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒

12、或噬菌体载体上，转化大肠杆菌转化大肠杆菌,便构成了该生物的基因文库。用限制酶切法直接从染色体用限制酶切法直接从染色体DNADNA中分离中分离 此方法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。此方法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。 此方法的缺点是：由于含有插入顺序，原始转录本不能被原核细胞识别，并将插入顺序切除，以形成成熟此方法的缺点是：由于含有插入顺序，原始转录本不能被原核细胞识别，并将插入顺序切除，以形成成熟转录本，因此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白质。转录本，因此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白质。返回用用PCRPCR方法方法扩增目的

13、基因片段扩增目的基因片段 PCRPCR是聚合酶链反应的缩写是聚合酶链反应的缩写 是一种在体外模拟天然是一种在体外模拟天然DNADNA复制过程的核酸扩增技术复制过程的核酸扩增技术 在有少量在有少量DNADNA模板、引物、四种模板、引物、四种dNTPdNTP、TaqDNATaqDNA聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制DNADNA变性、退火变性、退火及延伸的温度与时间，来合成新的及延伸的温度与时间，来合成新的DNADNA链，新合成的链，新合成的DNADNA链又可作为下一轮循环的模板。理论上经链又可作为下一轮循环的模板。理论上经n n次循环次循环后，后，DNA

14、DNA链可达链可达2 2n n返回用用PCRPCR方法扩增目的基因片段方法扩增目的基因片段返回克隆载体克隆载体 目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受体细胞；目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受体细胞； 为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体连接为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体连接 理想的载体理想的载体1 1、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数. .2 2、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割点，以便所要克隆的、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割点，以便所要克隆的DNADNA片段能被插入片段能被插入载体载体. .克隆载体克隆载体

15、 3 3、外源、外源DNADNA片段插入载体后，不得使载体的复制功能丧失片段插入载体后，不得使载体的复制功能丧失 4 4、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，以便利用这些标志筛选阳性克隆、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，以便利用这些标志筛选阳性克隆 5 5、携带外源、携带外源DNADNA的幅度较宽的幅度较宽 6 6、生物防护是安全的、生物防护是安全的克隆载体克隆载体pBR322pBR322克隆载体克隆载体 常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒 质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链DNADNA。质

16、。质粒具有复制能力，它的存在与否一般对细菌的生存没有决定性粒具有复制能力，它的存在与否一般对细菌的生存没有决定性影响。影响。 噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其DNADNA中的中的1/31/3对噬菌对噬菌体的生长并非绝对需要，因此可被外源性体的生长并非绝对需要，因此可被外源性DNADNA所替代，同时它可所替代，同时它可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量小于在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量小于23kb23kb克隆载体克隆载体 粘性质粒（粘性质粒（CosmidCosmid），是人工构建的、兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载体。克隆

17、容量可达），是人工构建的、兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载体。克隆容量可达45kb45kb。 酵母人工染色体：酵母人工染色体：2020世纪世纪8080年代发展起来的大片段外源基因克隆体系，其克隆容量可达年代发展起来的大片段外源基因克隆体系，其克隆容量可达2001000kb2001000kb。返回DNADNA分子的分子的体外重组体外重组 所谓重组所谓重组DNADNA分子就是把外源分子就是把外源DNADNA分子（目的基因）插入到载体中，使两种分子（目的基因）插入到载体中，使两种DNADNA分子连接起来分子连接起来 体外体外DNADNA分子重组有两种方法：分子重组有两种方法：1 1、粘性末端连接法

18、粘性末端连接法2 2、平头末端连接法平头末端连接法返回粘性末端连接法粘性末端连接法 用同一种或两种限制酶去消化载体和外源用同一种或两种限制酶去消化载体和外源DNADNA分子，可产生相同分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，进一步用的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，进一步用DNADNA连接酶将连接酶将断端封口，即可获得重组断端封口，即可获得重组DNADNA分子。分子。 用同一种限制酶处理外源用同一种限制酶处理外源DNADNA和载体，重组时可导致外源和载体，重组时可导致外源DNADNA特特别是质粒的自我环化别是质粒的自我环化 用碱性磷酸脂酶（不处理外源用碱性磷酸脂酶（不处理外源DN

19、ADNA分子）处理粘性末端的分子）处理粘性末端的5 5磷酸磷酸基，能促使载体与外源基，能促使载体与外源DNADNA分子连接。重组体每条链仍残留的一分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，待进入宿主细胞内可被修复个缺口，待进入宿主细胞内可被修复返回磷酸脂酶能防止载体的自我环化磷酸脂酶能防止载体的自我环化返回用两种限制酶处理载体也可防止环化用两种限制酶处理载体也可防止环化钝性末端连接法钝性末端连接法 用前述的化学合成法、逆转录法获得的用前述的化学合成法、逆转录法获得的DNADNA或或cDNAcDNA片断，以及某些限制酶切生成的片断，以及某些限制酶切生成的DNADNA片断，均为钝性末端，片断，均为钝

20、性末端，可用可用T4DNAT4DNA连接酶连接，也可将其改造成粘性末端再行连接：连接酶连接，也可将其改造成粘性末端再行连接：1 1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。2 2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源DNADNA分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两者形成重组体分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两者形成重组体返回钝性末端连接法钝性末端连接法返回末端转移酶处理末端转移酶处理退火退火二、重组二、重组DNADNA引入宿主细胞和筛

21、选鉴定引入宿主细胞和筛选鉴定 重组重组DNADNA引入宿主细胞引入宿主细胞1 1、转染：将噬菌体、转染：将噬菌体DNADNA引入宿主细胞的过程引入宿主细胞的过程2 2、转化：将质粒或染色体、转化：将质粒或染色体DNADNA引入宿主细胞的过程引入宿主细胞的过程转化是否成功取决:1)制备感受态细胞;2)重组DNA避免受体细胞核酸酶的降解. 重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定1 1、插入灭活法插入灭活法2 2、噬菌斑形成筛选法、噬菌斑形成筛选法3 3、核酸杂交法、核酸杂交法返回插入灭活法插入灭活法 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被

22、目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNADNA的某一抗药基因上并在此插入外源的某一抗药基因上并在此插入外源DNADNA时，时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。化菌株。返回返回插入灭活法插入灭活法限制酶切限制酶切转化转化含四环素含四环素TAT三、克隆基因的表达三、克隆基因的表

23、达外源基因在大肠杆菌体系中的表达外源基因在大肠杆菌体系中的表达外源基因在真核细胞体系中的表达外源基因在真核细胞体系中的表达返回四、基因工程的成就与展望四、基因工程的成就与展望在农业上的成就与意义在农业上的成就与意义在工业方面的成就与意义在工业方面的成就与意义在制药工业中的成就与意义在制药工业中的成就与意义癌症的研究与治疗癌症的研究与治疗遗传病的预防与治疗遗传病的预防与治疗 “后基因组时代后基因组时代”将是将是“蛋白质组学时代蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白究，包括研究蛋白质结构、功能与应用

24、及蛋白质相互关系和作用。质相互关系和作用。 蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。人工改造与合成，最终获得商业化的产品。五.蛋白质工程（1 1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2 2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3 3）借助核磁共振和）借助核磁共振和X X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三维晶体结构; ;n 蛋白质工程

25、蛋白质工程（4 4）设计各种处理条件，了解）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；去折叠等对其活性与功能的影响；（5 5）设计编码该蛋白的基因改）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；造方案，如点突变；（6 6）分离、纯化新蛋白，功能）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。检测后投入实际使用。思考题1.目的基因获得的方法有哪些？2.基因工程包括哪些步骤？插入灭活法插入灭活法 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNADNA的某一抗药基因上并在此插入外源的某一抗药基因上并在此插入外源DNADNA时，时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。化菌株。返回限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 由由SmithSmith在在197019