单克隆抗体与基因工程抗体制备

1、 单克隆抗体与基因工程抗体制备多克隆抗体(Polyclonal antibody) 概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清，是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的，称为多克隆抗体。 存在的问题 为不均一物质特异性和亲和力差, 批间重复性差， 用于免疫学检测容易出现交叉反应单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb) 概念: 通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体. 特点: 针对单一表位 结构相同 功能均一 杂交瘤技术的理论基础 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技

2、术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，杂交瘤技术流程 两种亲本细胞的选择与制备 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选与克隆化两种亲本细胞的选择与制备 小鼠骨髓瘤细胞 免疫脾细胞 骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 一般要求 ： 与骨髓瘤细胞同源的小鼠（ Balb/c小鼠）812周龄20g25g体重 用高纯度高活性抗原刺激免疫小鼠

3、免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂， 10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）。冲击免疫（融合前3天进行） 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果细胞融合 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。骨髓瘤细胞 PEG 杂交瘤细胞 脾细胞 细胞融合剂： PEG 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结

4、构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同 免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。 融合比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 （寿命短，5-7天死亡） 杂交瘤细胞 （分泌抗体和永生性） 未融合的瘤细胞杂交瘤细胞的筛选与克隆化细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT2.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷

5、酸谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT选择培养基的原理 HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+） 融合后不同细胞在HAT培养基的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细

6、胞阳性杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞在HAT中生长，其中仅少数是分泌特异性McAb的细胞，而且有的培养孔生长多个细胞群落，必须筛选。 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。 克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法有限稀释法 特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.51个

7、细胞阳性杂交瘤细胞的冻存 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染 配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml) + 细胞冻存液(30%40% 牛血清，50%60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30-70液氮 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 单抗生产的方法： 动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1

8、周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。 体外培养法：5%CO2，37孵育数天，收集上清，离心。但收集的抗体含量不高 腹腔注射法单克隆抗体的纯化 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法 用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白亲和层析法 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原

9、抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。单克隆抗体的性质鉴定 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获

10、得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定 单克隆抗体特性 优点： 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备 缺点： 制备复杂，价格昂贵；反应强度不如多克隆抗体；应用有一定的局限性等等 单克隆抗体在医学中的应用 检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术基因工程抗体与抗体库技术 单抗体内应用和疗效受限原因： 1.鼠源性单抗对人体有较强的免

11、疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少 3.生产成本高,难于普及应用 人杂交瘤技术未获真正突破原因: 融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫 新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。 基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括 嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体。 抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。嵌合抗体(chimeric antibody) 从杂交瘤

12、细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 人源化抗体(humanized antibody)1. 将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体 特点: 针对单一表位 结构相同 功能均一 骨髓瘤细胞 PEG 杂交瘤细胞 脾细胞 细胞融合剂： PEG 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 具永生性 2.HGPRT+在HAT