海藻酸钠对食品蛋白质消化性的影响生物学专业

1、目 录摘要3关键词3Abstract3Key words3引言31材料与方法41.1材料41.1.1乳清蛋白 41.1.2海藻酸钠41.1.3主要试剂41.2主要仪器及设备51.3方法51.3.1海藻酸钠乳清蛋白复合凝胶的热处理即样品的制备 51.3.2流变学实验测定 51.3.3扫描电镜实验测定 51.3.4电泳实验 5 2结果与分析 5 1.3.4电泳实验 5 2.1模拟胃环境诱导形成凝胶情况 62.2电镜学实验 62.3 流变学实验82.4 电泳实验 113讨论113.1 流变实验 113.2扫描电镜实验113.3电泳实验11致谢11参考文献11海藻酸钠对食品蛋白质消化性的影响 摘要：海

2、藻酸钠（NaAlg）是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖碳水化合物,具有良好的生物降解性和生物相容性,是一种天然线性多糖,由-D-甘露糖醛酸(M)和-L-古罗糖醛酸(G)构成。蛋白质是生命活动的基本功能单元，蛋白质具有柔性，存在许多不同的结构状态，蛋白质的多种构象态构成了蛋白质的构象空间，蛋白质很多生理功能的发挥是通过结构转换实现的。本实验探索海藻酸钠作为天然高分子对于人体蛋白质消化性的影响，从电镜，流变和电泳三个方向进行研究。关键词：海藻酸钠；蛋白质；消化性Effect of sodium alginate on protein digestibility of foodAbstract

3、： Sodium alginate (NaAlg) is a kind of polysaccharide carbohydrate extracted from kelp or sargassum which belongs to brown algas.NaAlg has a good biodegradability and biocompatibility,which is one kind of natural linear polysaccharide composed of Dmannuronic acid (M) and Lguluronic acid(G).Protein i

4、s the basic functional which also act as flexibility is very important for their functions .Proteins accomplish their physiological network of conformational substates.3% (w/v) soy protein is contained in the fermentation broth of the waste product and the human fecal flora. 2% sodium alginate diet

5、to maintain a diet containing 20% of the mice had a certain impact on the gut. Polysaccharide, especially kelp polysaccharide, inhibit the ammonia, phenol, and through the production of human fecal flora.Key words: Sodium alginate；protein；digestibility 海藻酸钠是一种具有前瞻性的多糖，提取自海藻天然产物中，具有健康等特征，作为高负电荷多糖，与乳清

6、蛋白(WP)在不同的生物聚合物比中加热。在与模拟胃液混合的过程中，海藻酸钠与乳清蛋白混合物在生物聚合物比中高于0.01，立即产生自行组装的凝胶，在更高的生物聚合物比率下形成更强的凝胶。SDS - PAGE结果表明，在与多糖结合后，乳清蛋白的可消化性被推迟，随着生物聚合物质量比的增加而增强。而带高负电荷的多糖则有更大的潜力来延缓乳清蛋白的消化。本实验通过扫描电子显微镜(SEM)对模拟胃消化前后的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶的显微结构进行了表征，并证实了该凝胶延缓了乳清蛋白的消化。同时，基于现代人对于减肥、苗条身材的追求，科学家一直致力于研究健康而又前沿的延缓食物中蛋白质、脂肪等物质的消化吸收的功能性产

7、品。本实验研究海藻酸钠对于人体食物中蛋白质的消化性作用，并研究具体的浓度梯度对于食品中蛋白质消化性的影响。 用经过稀释海藻酸钠作为天然生物大分子，由于其立体结构的特殊性，表现出特殊的物理化学性质，具有可生物降解、良好的生物相容性，从而广泛地应用于医药和生物技术等领域。用经过稀释且pH值为1.2的盐酸溶液作为模拟胃液SGF。冷却后的乳清蛋白海藻酸钠混合液加入到装有SGF的透明瓶子中，混合液体积和SGF体积比为1:1观察复合物在模拟胃肠环境中的结构变化，并进行拍照。作对照试验，分别取0.2、0.4、0.6、0.8的海藻酸钠溶液进行试验，测定不同浓度对蛋白质消化性的不同影响。1乳清蛋白富含必需氨基酸

8、，是一类营养价值较高的优质蛋白质，含有-乳球蛋白， -乳白蛋白，牛血清蛋白，免疫球蛋白，乳铁蛋白，糖巨肽、乳过氧化物酶等多种活性成分。随着乳源活性肽研究与产品开发的兴起,发现乳清蛋白中含有具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒 等生物活性的潜在肽段2-6, 这对进一步提升乳 清蛋白产品的营养功能 , 提高乳清蛋白产品的附加值及开发利用具有重大意义 。乳清蛋白源生物活性肽来源于天然乳清蛋白, 虽然在乳中的含量不高, 但却具有极高的营养价值、食用安全性及生理保健功能, 在促进机体的生长、发育和疾病防治等方面都起着重要的作用, 可作为功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常

9、生活中。目前, 市场上应用乳清白及其活性肽的产品有:强化-乳白蛋白或乳铁蛋白的婴儿配方奶粉、降低婴儿过敏反应的婴儿配方奶粉、添加了活性增长因子的医用配方营 养奶粉 、含有 IgG或乳铁蛋白的防龋齿产品、在酸奶中添加乳铁蛋白的骨骼健康产品 、促进蛋白质合成的营养运动产品以及添加降血压肽的发酵乳产品等。7 本实验采用乳清蛋白，模拟人体胃液消化奶制品中的乳清蛋白，也是因为当今人们越来越注重奶制品的摄入，从奶制品中摄取蛋白质，从而更好地均衡健康，增强人体免疫力。研究海藻酸钠对食品中乳清蛋白的消化性，也是因为乳清蛋白是一种常见的人体摄入的蛋白质。 11 材料海藻酸钠，乳清蛋白113 主要试剂 Tris、

10、甘氨酸、TEMED；丙烯酰胺，考马斯亮蓝R250；Pepsin（胃蛋白酶活力1：1000），蛋白质Marker（10-130kD）；其它化学试剂均为分析级或生化级。12 主要仪器及设备 Mini-PROTEIN 蛋白质电泳仪，美国BIO-RAD公司；SEM（S-3000，Hitachi Science System Ltd.，Hitachinaka，Japan）；Tanon数码凝胶图像处理系统，EHSY LAB公司。13 方法13. 1 海藻酸钠乳清蛋白复合凝胶的热处理即样品的制备将定容完成后的0.8海藻酸钠溶液稀释成4个浓度梯度，分别是0.2、0.4、0.6、0.8，其中0.2的海藻酸钠溶液

11、是以2.5ml海藻酸钠与7.5ml水混合摇匀；0.4的海藻酸钠溶液是以5ml海藻酸钠与5ml水混合摇匀；0.6的海藻酸钠溶液是以7.5ml海藻酸钠与2.5ml水混合摇匀。取15ml稀释后的海藻酸钠以体积比1:1与乳清蛋白混合，充分摇匀后放入85水浴锅中加热30min。分别取四个烧杯各自提前加入20mlSGF，直至海藻酸钠-乳清蛋白溶液降温到室温以后，将复合溶液用20ml的针筒打入SGF溶液中，形成凝胶。放入冰箱中保存一个晚上。13. 2 流变学实验测定 提前一天晚上在锡箔纸上将样品做好，将已经形成的凝胶用小刀片切成圆形，直径为5cm，厚度为2mm。 将压力机接上电源，打开黑色小钮，0至1；打开

12、压力阀，至气压升至60再关上。打开水浴锅，调整至25，三个按钮全开。打开流变仪，侧面按钮从0到1；打开电脑，打开软件，流变仪自检完成后，单击inicidize，把流变仪的白色罩子拿下来，把钻子安装上去。单击set zero gap，钻子下去后，停止后再点击旁边的set，等温度降到10后单击lift position；直接上样；再点击Meas position，钻子下降。等提示框出来后，单击continue，和ok.然后拷贝数据。 13. 3 扫描电镜实验测定 凝胶中加入氢氧化钠溶液，使酶失活，加入戊二醇，过夜处理。然后在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中漂洗三次（每次15分钟）。洗涤的凝胶指示剂在30

13、至100范围内的一系列含水乙醇溶液中脱水。然后将脱水样品临时点干燥，使用溅射涂布机（EMS575X，电子显微镜科学，Hatfield，PA）将其安装在铝坯上并用10nm的铂涂布。用SEM（S-3000，Hitachi Science System Ltd.，Hitachinaka，Japan）进行SEM观察，加速电压为15kV。检查了每个治疗的两个领域，并提出了两个领域之一。捕获了放大倍数为2500的数字显微照片。134 电泳实验 将0.2、0.4的样品在37的水浴锅中预热10min，这个过程中在离心管中提前加入20l的碳酸氢铵，在加入酶之后，消化即开始。此时开始计时，5min，10min，3

14、0min，60min，90min，120min时取上清消化液100l。消化液接触到碳酸氢铵即意味着消化反应停止，在消化完成后，取20l的反应液加入到另一个对应的离心管中，加入5l的Buffer做点样处理。酶和纯蛋白样品做同样处理，纯蛋白进行稀释处理，稀释到原来的8倍。然后将样品在沸腾的水浴锅中煮10min，进行离心，如果发现进水现象，需要重新取反应液加入Buffer沸水煮10min进行离心。 电泳实验开始前，需要进行一系列的准备工作。首先进行洗板，用清水冲洗，然后用洗手液的泡沫将板上的污渍轻轻洗净，清水冲洗，蒸馏水冲洗时水柱成股流下证明洗净，然后酒精淋洗，晾干。等到板完全干了以后，将板放入固定

15、架上，进行酒精检漏。等待10min左右，发现液面没有下降，证明制板成功，没有漏液现象。将酒精倒出。制备分离胶，将分离胶用1000l枪头加入到板子中，液面在固定架后方绿色小凹槽处。立即进行压水，由于水的冲击力可能引起胶形状的破坏，使用200l的枪头进行压水。静置直到可以观察到一条明显的分界线，证明胶已经凝固，此时倒出水，用滤纸将多余的水吸干。制备浓缩胶。将浓缩胶用1000l的枪头加入到板子空余空间，直至浓缩胶溢出，立即插入梳子。等到浓缩胶凝固，大约40-60min，将固定架放入电泳池中，从固定架里面开始倒入电泳液，使电泳液溢出到电泳池中，液面到达2gels标记处。 将已经做好的点样，逐一加入凹槽

16、中，其中第一个凹槽空出，标样蛋白加入第二个凹槽中，每个点样都是取10l，Marker取4l。加样完成后，盖上盖子，对准红黑正负极，打开电泳开关，设定参数值：180V电压，2h,然后点击run按钮，开始电泳。在电泳过程中，一旦出现电流不稳现象，即停止电泳，通过调节电压大小使得电流保持在原先电流值。直到肉眼可以看见蓝色Buffer溢出固定架进入电泳液，即停止电泳。2 结果与分析 21 模拟胃环境诱导形成凝胶情况0.8图1 海藻酸钠-乳清蛋白凝胶 如图，分别为浓度0.8,0.6，0.4，0.2的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶，可见0.2的凝胶成胶性较差，几乎成絮状，0.4，0.6，0.8浓

17、度的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶成胶性逐渐增强，由此可以预测海藻酸钠-乳清蛋白凝胶浓度越高对于人体蛋白质消化性的延缓作用应该越好。 22 电镜实验根据文献可知海藻酸钠分子是由-D-1,4-甘露糖醛酸和-L-1,4-古罗糖醛酸两种单体组成的嵌段线性聚合物。在一个分子中，可能只含有其中一种糖醛酸构成的连续链段，也可能由两种糖醛酸链节构成嵌段共聚物8.。两种糖醛酸在分子中的比例变化，以及其所在的位置不同，都会直接导致海藻酸钠的性质差异，如粘性、胶凝性、离子选择性等。如图可观察到海藻酸钠的组织结构。表示蛋白质的团状结构几乎找不到。初始样品中会有代表凝胶复合物的纤维网络结构和代表蛋白质聚集的团状结构，经过一个

18、小时的消化，蛋白质聚集的网状结构会有部分消失，但是不会全部消失，因为多糖的存在会保护蛋白质，阻止胃蛋白酶对其的消化。如图，消化前后，蛋白质多糖交联结构依然存在，说明胃蛋白酶对其消化很少；凝胶结构中蛋白质聚集的部分很少，不能判断胃蛋白酶对其消化情况如何。可能是凝胶制作的时候，蛋白质和多糖混合得很好，形成了致密的交联结构，完全将蛋白质保护住了。MP图2 海藻酸钠-乳清蛋白原样的扫描电镜结果PM图3 浓度为0.2的海藻酸钠-乳清蛋白消化后扫描电镜结果，其中M为凝胶复合物为主的纤维网状结构，P为蛋白质为主的颗粒网状结构2. 3 流变实验 如图二，为海藻酸钠-乳清蛋白凝胶的流变学结果。由图可知，储能模量

19、大于耗损模量，证明能够成胶。且0.8浓度的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶的成胶性是最好的。 G表示储能模量，G,表示耗损模量。从图中可以看出：第一，在实验所涉及的质量浓度比中，海藻酸钠-乳清蛋白复合物都表现出了凝胶的性质。第二，复合物凝胶的弹性随质量浓度比的增大而增大。由此可知，高多糖浓度可以促进乳清蛋白和海藻酸钠之间的交联程度，增大凝胶强度。第三，海藻酸钠-乳清蛋白的凝胶弹性很强，因为海藻酸钠拥有很高的电荷密度，同蛋白质之间引起了很强的相互作用。 该流变结果与小瓶子结果由出入。用肉眼观察可以看出，图一中质量比为0.025凝胶样品没有形成凝胶，仍为溶液状态。可能是由于流变样品是放置在4的冰箱过夜，进行

20、水化作用，会形成凝胶，但是凝胶强度很弱，所以在流变测定的时候会显示出微弱的凝胶特性。 对于所有的胶体样品， G和G, 所表现出的低频率都在频率范围内。而且，对于乳清蛋白-海藻酸钠，储能模量随着浓度比增加，表示高浓度的海藻酸钠就可以提高与蛋白质间的联结，因此可以增加凝胶的强度。-0.2G-0.2G-0.4G-0.4G-0.6G-0.6G-0.8G-0.8G图3 浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶流变情况24 电泳实验 如图为乳清蛋白体外胃蛋白酶消化过程的SDS-PAGE图谱，该乳清蛋白主要由-乳白蛋白（-La）和-乳球蛋白（-Lg）组成。胃蛋白酶对乳清蛋白的分解作用

21、不明显（消化时间达到2h时仍未出现明显降解）。胃蛋白酶对不同蛋白组分的消化情形与其空间结构紧密相关9。-La属于溶菌酶家族的蛋白，含有123个氨基酸残基，四个二硫键，其三级结构类似于溶菌酶，是一种密集球形的单体球蛋白10，-Lg是高度结构化的蛋白质，具有紧密的三级结构，单体近似球体11。0.2的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶未完全消化的条带最多，而0.4，0.6，0.8浓度的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶随着浓度递增，大分子蛋白质和小分子多肽逐渐减少，意味着人体内蛋白质消化性随着多糖浓度递增而加强。根据第二列的纯蛋白对照可知，随着时间的流逝，大分子蛋白质和小分子多肽逐渐减少，意味着随着消化时间的延长，海藻酸钠

22、对于蛋白质消化性的延缓作用逐渐增强。 在模拟胃液消化期间乳清蛋白水解模式显示出乳清蛋白亚基的条带消失和密集肽带的出现，其在消化5分钟时发生。当消化时间增加到90和120分钟时，尽管乳清蛋白亚基的条带继续出现，在30和60分钟显示的致密消化肽带消失。这种现象是由肽进一步消化引起的。关于消化乳清蛋白分离物，其中在消化2分钟后出现致密肽带，但随时间而减少。消化模式的这种差异可能是由不同的胃蛋白酶与蛋白质质量比所引起的。蛋白质的消化率显示取决于变性程度。在加热乳清蛋白期间诱导蛋白质的展开和肽键的暴露，其易于胃蛋白酶切割。在加热后保持其天然状态的蛋白质对胃蛋白酶具有很强的抗性。在本工作中利用胃蛋白酶与蛋

23、白质的比例，变性蛋白质在5分钟内开始分解成较小的肽。随着时间的增加，蛋白质的消化增强，乳清蛋白亚基带的消失和分子量较小的肽出现。 图4 浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8海藻酸钠-乳清蛋白凝胶电泳情况170 kDa170 kDa170 kDa170 kDa170 kDa170 kDa565554444444987654321170 kDa13010070554035251510LFBSA-LG-LACGMP图5 纯蛋白的电泳情况3 讨论 31 结果 经实验发现，海藻酸钠对食品蛋白质消化性有延缓的作用，且随着海藻酸钠浓度递增而延缓作用渐强。32 不足 流变实验影响整个流变实验的是上样的过程

24、，由于0.2浓度的海藻酸钠-乳清蛋白凝胶成胶性较弱，几乎成絮状，因此在上样时需要用板子将其轻轻地铺平在上样区，使样品平铺均匀，上样时不能破坏凝胶的完整性，否则会影响后期的储能模量和耗损模量数值的精确性。扫描电镜实验消化的程度太过了，而且多糖和蛋白质的交联也不太好。 电泳实验由于电泳实验前有一个关键的消化步骤，因此消化结果会直接影响电泳结果。由于实验要进行参照，因此时间的把握非常关键，5min，10min，30min，60min，90min，120min时取样，如果能用秒表计时最好。由于移液枪的使用寿命问题，枪头可能与移液枪接触不紧实，在取样过程中枪头掉入凝胶中，扎破凝胶，导致消化性出现问题，甚

25、至影响后续条带的分布等等。因此为了实验的科学性结果，要注意操作时将枪头紧实。在正式电泳时，要注意将电泳液灌满固定器，否则会影响后续加样。在加样时，为了避免某一凹槽的样液流入旁边凹槽中，一定要在移液枪中的样品完全流完再将枪头移走。开始电泳后，由于电压不稳的问题会导致最后呈现的条带不平直，因此需要观察电流数值，通过调节电压来使电流保持稳定在某个数值，尽管如此，还是不可避免的得到的条带成锯齿状，分析可能是预实验时，电压参数设定过高的原因。此外，由于纯蛋白浓度过高的问题，凝胶上呈现的条带会有墨点状，同时由于浓度过高可能“溢出”影响别的条带，所以电泳前必须要将纯蛋白稀释。在电泳的过程中可能出现两块凝胶不

26、是同时跑完的情况，务必将电泳池翻转过来，查看另一面的电泳情况再决定电泳是否停止。 33 展望 海藻酸钠的功能还有待开发，作为一种天然多糖，人们可以从海藻酸钠上受益颇多，但是也需要科学家孜孜不倦的实验与科研。海藻酸钠在蛋白质消化性延缓作用上的建树已经有目共睹，以后也会有更宽广的领域。 致谢 这两个多月来，一直在曾老师的实验室做实验，师兄师姐们帮了我们不少，包括实验试剂的购置，器材使用的指导说明，还有仪器借用的签字等等。首先要感谢师兄师姐们的援助之手。其次是我的同组伙伴，同学。她们从大二SRT项目就开始了这项实验，一直到现在的毕业设计，依然延续了这个实验项目，期间她们给了我很多帮助、耐心的指导等，

27、并且鼓励我不要放弃，在遇到实验困难时和我同舟共济，都让我感受到实验伙伴的重要性。同时，指导老师尽管远在瑞士访学，可依然给予我们很多建议及意见，这也是我们实验得以做下去的最大动力。最后，感谢自己一直以来没有打退堂鼓，将整个实验完成并且得到了最终的实验成果。 以上参考文献：1 Hu B, Chen Q, Cai Q M. Gelation of soybean protein and polysaccharides delays digestionJ. Food Chemistry, 201610周志红, 唐传核, 杨晓泉. 大豆蛋白的体外模拟消化过程及热处理的影响J. 食品科学, 2006, 26(1); 37-402 Gauthier SF, Boutin Y, Montoni A, etal. Immunomodulating properties of a whey protein isolate, its enzymatic digest and peptide fractionsJ. Int, Dairy J, 2008, 18: 260-2703 Hernandez