磷酸化 2011 硕士

1、蛋白质磷酸化与非磷酸化蛋白质磷酸化与非磷酸化 非活性蛋白与活性蛋白的构象之间的转换是通过可逆共价修饰调节蛋白质的方式，蛋白激酶则是这一过程催化磷酸化的重要蛋白，而磷酸酯酶是去磷酸化的重要蛋白. 已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸.根据是否有调节物来分又可分成两大类：根据是否有调节物来分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白质激酶（信使依赖性蛋白质激酶（messenger-dependent protei

2、n messenger-dependent protein kinasekinase），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。蛋白激酶的催化作用：蛋白激酶的催化作用： 使调节酶磷酸化 (1)磷酸化酶激酶P激活 (2)糖原合成酶P失活 使许多蛋白质磷酸化 (1)核中组蛋白磷酸化加速核酸的复制，转录。 (2)核糖体蛋白质磷酸化加速蛋白质合成通性。 (3)使膜蛋白磷酸化加速物质的转运。蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用蛋白质磷酸化在细胞

3、信号转导中的作用(1). 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于 胞内信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacyl glycerol）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。(2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶活性。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速更迅速的反应。(3).对外界信号具有级联放大级联放大作用；(4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应持续反应。 被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化。1、Ser/

4、Thr蛋白激酶 蛋白磷酸化是蛋白激酶将磷酸基因转移到特定底物蛋白上的共价修饰过程，调控蛋白质的酶学活性或生物学功能。分为: cAMP依赖的PK Ca2+/磷脂依赖的PK Ca2+/ （CaM）钙调蛋白依赖的PK cGMP依赖的PK 近年发现新成员DNA依赖的PKcAMP依赖的蛋白激酶（ cAMP dependent protein kinase.APK） cAMP-依赖蛋白激酶是一种四聚蛋白酶，含有两个调控亚基和两个催化亚基。当cAMP-依赖蛋白激酶的调控亚基结合时，激酶解离成两个具有催化活性的蛋白激酶（由催化亚基形成）和一个二聚的调控亚基。 cAMP-依赖蛋白激酶被活化后，它解离出来的活性蛋

5、白酶能够催化ATP分子与目标代谢酶分子的磷酸化反应。一般是代谢酶的Ser或Thr残基的羟基被ATP磷酸化，其结果是代谢酶被抑制或激活。磷酸化代谢酶可在蛋白磷酸酶作用下去磷酸化而激活或失活。cAMP即是通过上述机制实现对代谢酶活性的调控。结构与功能 2个调节亚基（R）+2个催化亚基（C）APK全酶复合体（R2C2）（无cAMP时，无活性） cAMP与特异R亚基结合构象变化 R亚基二聚体+2个有活性C亚基,各种哺乳动物细胞于不同水平表达3种C亚基亚型(CCC)和4种R亚基亚型(R R R R ) 结合成全酶APK 型和 型.不同R亚基亚型主要区别: RMg2+/ATP高亲和位点 R自身磷酸化 细胞

6、分布与移位细胞分布与移位R亚型主要位于胞浆、神经组织中，R亚型分布于浆膜、细胞骨架成分、树突、分泌颗粒和核膜，是R 作用于特定的锚定蛋白所致底物多巴胺和cAMP调节的磷蛋白（dopamine and adenosine-3, 5-monophosphate regulated phosphoprotein DARPP-32）是PKA的有效底物，存在于具有D1多巴胺受体的神经细胞胞浆中。II、 Ca2+ /磷脂依赖的蛋白激酶（ Ca2+/phospholipid dependent protein kinase）经第二信使Ca2+ 、甘油二酯DG或磷脂酰丝氨酸刺激而激活的蛋白激酶称为Ca2+ /

7、PL-PK或PKC，是肌醇磷脂信号传导通路的关键环节。多种激活剂与质膜上特异受体结合磷脂酶C 肌醇磷脂（PIP2） 水解 三磷酸肌醇（IP3）+甘油二酯（DAG）生物效应 蛋白磷酸化CaMPKCa2+胞内Ca2+池 一系列细胞蛋白磷酸化 PKC 磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的两个酶解 产物：肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）。C激酶（PKC）是依赖于Ca2+的蛋白质激酶。由于IP3所引起的细胞质Ca2+浓度升高，导致C激酶从胞质转运到靠原生质膜内侧处，并被DAG和Ca2+的双重影响所激活。 C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，原因是后

8、者大大提高了C激酶对于Ca2+的亲和力，从而使得C激酶能被生理水平的Ca2+离子所活化。C激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有一个催化结构域和一个调节结域。1、IP3IP3作用作用：IP3与IP3受结合后，变构，钙通道打开，贮于内质网的Ca2+释放入细胞质内，使胞质Ca2+浓度升高，引起一系列效应。如:平滑肌收缩等.2、DAGDAG作用作用：激活蛋白激酶C,将存在于靶蛋白质中得丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化， 改变靶蛋白质的活性。如:糖原合成酶磷酸化后，停止合成糖原。3 3、DAGDAG与与IP3IP3的协调作用的协调作用IP3 细胞质中Ca2 + 糖原合成酶活性蛋白激酶C 使IP3 诱导增

9、高糖原磷酸化酶活性的过程终止。 4 4、DAGDAG的激活机理的激活机理 DAG 增加蛋白激酶C对Ca2 + +的亲合性在Ca2 +生理水平上被活化。蛋白激酶C为 77kd , 催化区抑制调节区,当DAG结合到蛋白激酶C上，解除酶的调节区的抑制作用，使酶发挥催化活性。III、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶钙调蛋白依赖的蛋白激酶 CaM（钙调蛋白）作为细胞内Ca2+受体，由148个氨基酸碱基组成的可溶性球蛋白 结构特点：（1 ）30%的酸性氨基酸，过量羧基提供了Ca2+可逆性结合的基团。（2）不含能使肽链定型的成分，即易氧化的半胱氨酸和羟脯氨酸，因而CaM具有高度灵活的，可与机体蛋白相互作用的

10、三级结构。概念：CaM对第二信使Ca2+起反应所激活的蛋白激酶成为多功能的Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶（Ca2+Calmodumin dependent protein kinase，CaM-PK）1978年schulman 首次在突触体膜上发现了II型CaM-PK（CaM-K ) 研究发现 当Ca （二价正离子）结合到E螺旋区和F螺旋区之间的泡区时，引起每个螺旋在它的轴线附近旋转并改变其所在的位置 使CaM转变成为一种对靶蛋白质具很高亲和性的构象 CaM只有在结合Ca （二价正离子）形成CaMCa（二价正离子）复合物才具生物活性。以两种方式调节代谢：a. 直接与靶酶作用 ；b. 活化依赖

11、于CaMCa（二价正离子）的蛋白激酶CaM的一级结构在进化上有很强的保守性的一级结构在进化上有很强的保守性a、 同真核生物CaM呈现免疫交叉反应b、 CaM结构若突变， 容易致死。保守性 CaM二级结构是两个类似的球状叶片通过一段肽链的 连接 而组成整个的分子a、 每一个球叶中含两个Ca2+结合位点，每个结合位点-12个AA残基，腔式结构，半径0.1nm, 两旁 连接两条相互垂直的-螺旋-有8个AA残基,组成EF手图像，两个EF 手单位间相距1.1nm b、 在一个球叶中，两个Ca2+结合位点对Ca2+有很高亲和性,在另一个球叶中的位点则亲和性较低 CaM的生理功能的生理功能a、 调节环式核苷

12、酸代谢b、 调节Ca2+代谢c、 细胞运动，收缩体系与细胞形状d、 糖质的代谢e、 细胞分裂与核酸代谢f、 神经递质的合成与释放g、 前列腺素与磷脂代谢h、 调节植物细胞代谢i、 CaM是细胞代谢调控的综合剂 CaM结构的结构的 EF手图象手图象许多钙结合蛋白串的钙结合位点是由一个许多钙结合蛋白串的钙结合位点是由一个螺旋区螺旋区-泡区泡区-螺旋螺旋区区的结构单位组成的结构单位组成IVIV、cGMPcGMP依赖的蛋白激酶依赖的蛋白激酶 (cGMP dependent protein kinase,GPK)(cGMP dependent protein kinase,GPK) Ashman Ash

13、man 等等19631963年从肾脏首次发现年从肾脏首次发现cGMPcGMPV V、DNADNA依赖的蛋白激酶依赖的蛋白激酶( DNA dependent protein kinase,DNA-PK)( DNA dependent protein kinase,DNA-PK) 是一类存在于细胞核内，能被是一类存在于细胞核内，能被DNADNA激活的特异的激活的特异的Ser/Thr PK Ser/Thr PK 引起引起多种核结合蛋白磷酸化。多种核结合蛋白磷酸化。第二类、第二类、 酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 对于许多生长因子受体的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用。表皮生长

14、因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体都拥有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区。 具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。胞外配体结合区：RPTK的N端大约500-850个氨基酸组成亲水性胞外配体结合区域，氨基酸序列变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结合的结构基础。跨膜结构区：是连接受体细

15、胞内、外两部分，镶嵌在细胞膜中的结构，在靠近膜内侧C端常常是由碱性氨基酸形成簇状结构。胞内活性区：保守性较高，由三个不同的部分组成。与跨膜区相连的近膜区包括41-50个氨基酸，可能是RPTK活性的功能的调节部位。第二部分为活性位点所在的催化区，其氨基酸组成具有很高的保守性。该区含有ATP结合位点和底物结合位点，可能是不同类型RPTK底物特异性的决定区域。第三部分是多变的C末端，包括70-200个氨基酸，主要是由小分子量氨基酸组成的亲水性结构，具有高度的可塑性。（二）蛋白激酶抑制剂1、Ser/Thr蛋白激酶抑制剂（1）与ATP竞争的抑制剂 H系列化合物W-7N-(6-aminohosyl)-5-

16、chloro-1-nahpalenesulfonamide是CaM拮抗剂，以Ca2+依赖方式与CaM结合选择性抑制Ca2+/ CaM依赖性激酶，也能与ATP竞争抑制蛋白激酶，但作用较弱。H-89 选择性的PKA抑制剂ML-9 是MLCK（肌球蛋白轻链激酶）的特异抑制剂H-7 是蛋白激酶C（PKC）较为有效的抑制剂（2）含吲哚咔唑生色基团的抑制剂Staurosporine 来源于放线菌属 Ki最低，是PKC、APK等抑制剂UCN-01 较特异抑制PKC，还有抗肿瘤作用。2、与蛋白激酶辅助因子竞争的抑制剂（1）PCK抑制剂 Calphostins：是作用于PCK的的DAG结合位点的抑制剂 鞘氨醇

17、能与Cu2， PS和DAG竞争抑制PCK，也是CaM的拮抗剂（2）CaM依赖性蛋白磷酸抑制剂 甲状腺素：能与CaM竞争MCLK结合而抑制其活性 异喹啉衍生物KN-62: CaM K II 抑制剂（较为特异的）（3）与蛋白/肽底物竞争抑制剂 Walsh：是较为特异的APK抑制剂。同肽底物竞争（三）蛋白磷酸酯酶（protein phosphatase 。） 70年代末PTPase活性首次被发现，已知对Ser/Thr激酶的磷酸酯酶有PP1,PP2A,PP2B,PP2C,PPx等分布涉及各组织以至细胞器，定位各有有侧重，均有亚型 PP1(位于胞浆为为PP11 糖原分子为PP1G,位于肌丝为PP1M,核

18、为PP1N) PP2A主要存在胞浆，少数在线粒体和核 PP2B与膜连接有关（调节亚单位 氨基末端甘氨酸残基豆蔻化） PP2C只要存在于胞浆 PPC存在于细胞膜 PPx存在于线粒体 PP-1是糖代谢中的一个关键酶，具有很高的活性，其催化亚基为38kDa，可以与其它组分或调节亚基组成全酶。PP-2A全酶包括一个36kDa的催化亚基和一个65kDa的调节亚基。PP-2B是目前所发现的唯一受Ca和CaM调节的蛋白磷酸酶,催化了磷酸化酶激酶亚基的脱磷酸化作用。由61kDa的A亚基和16kDa的B亚基组成。A为催化亚基。PP-2C的分子量为43-48kDa，其活性需要mmol/L水平的Mg2+，现对其参与调节的生理过程知之甚少。 酪氨酸蛋白磷酸酶酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP）主要有:胞内型，跨膜受体型。两类PTP的共同点是它们 的催化域中氨基酸顺序极为相似，共有240个氨基酸，内含-HCXGXXR（S/T）G-的signature motif。胞内型PTP只有一个催化域。受体型中常有两个催化区，其不同类型的胞外结构往