细胞培养操作步骤

1、培养基的配置：根底培养基500ml+胎牛血活50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml艄牛血活2ml。依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套2.5必20 U、200pl 1ml,洒精灯1盏，液器1台，斜架1台，洒精喷壶1个，洒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶50 cm2,定量移液管5ml、10ml,枪头1ml、200小10 U，培养血，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibc。高糖培养基，胎牛血活，双抗，DMSO,胰酶，苯扎漠氨，75%洒精实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用洒精喷壶喷洒实验台面，并关闭 工作台翻开紫外灯照射30

2、min后开始实验操作。首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37 C的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。 假设种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。实验步骤一、原代细胞的培养1.紫外消蠹30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用洒精消蠹操作 者的双手。2.将所需的培养基确保瓶身十净后放于工作台面内，点燃洒精灯，将培养基瓶口用洒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在洒精灯上消蠹2-3次，旋开瓶盖后再次分别消蠹瓶口和瓶盖，分别放于洒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜 架上，瓶口

3、对准洒精灯，且放在距离洒精灯最近的位置，瓶盖置于洒精灯的另一侧。3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在洒精灯上消蠹2-3次，旋开后分别再次消 蠹瓶口和瓶盖2-3次分别放于洒精灯两侧，把保种管在超净台外用洒精棉球 擦拭下2/3后拿进超净台内在洒精灯上消蠹保种管口2-3次放于台面左手边， 取1ml移液器快速移动在洒精灯上消蠹1-2次，然后再装上枪头吸取保种管 内的细胞液，悬:空移入培养瓶内。4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在洒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于洒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬:空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在洒精灯上消 蠹

4、2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。5.将培养基瓶口和瓶盖消蠹2-3次后拧紧，熄灭洒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6.将培养瓶放于28C ,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在CO2培养箱内培养10-12h,瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜 下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。二、培养液的更换1.紫外消蠹30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用洒精消蠹操作 者的双手。2.将所需的培养基确保瓶身十净后放于工作台面内，点燃洒精灯，将培养基瓶口用洒精棉球擦拭后，再将瓶

5、口对准在洒精灯上消蠹2-3次，旋开瓶盖后再次分别消蠹瓶口和瓶盖，分别放于洒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜 架上，瓶口对准洒精灯，且放在距离洒精灯最近的位置，瓶盖置于洒精灯的 另一侧3.将培养瓶瓶口在洒精灯上消蠹2-3次，旋开后分别再次消蠹瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于洒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬:空倒进污缸，在洒精灯消蠹2-3次瓶口，4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在洒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于洒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬:空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在洒精灯上消 蠹2-3次后拧紧平放。5.将培养基瓶口和瓶盖消

6、蠹2-3次后拧紧，熄灭洒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6.将培养瓶放于28C ,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%即可进 行细胞的传代。三、细胞传代1.紫外消蠹30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用洒精消蠹操作 者的双手。2.将所需的培养基，胰酶确保瓶身十净后放于工作台面内，点燃洒精灯，将培养基和胰酶瓶口用洒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在洒精灯上消蠹2-3次，旋开瓶盖后再次分别消蠹瓶口和瓶盖，分别放于洒精灯的两侧。特别是将培 养基瓶放于斜架上，瓶口对准洒精灯，且放在距离洒精灯最近的

7、位置，瓶盖 置于洒精灯的另一侧。3.将培养瓶瓶口在洒精灯上消蠹2-3次，旋开后分别再次消蠹瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于洒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬:空倒进污缸，在洒精灯消蠹2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在洒精灯上消蠹1-2次， 然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。4.将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。假设看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；假设看不 到针孔样缝隙和细胞脱落，那么需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速

8、竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最正确消化状态。用移液器将胰酶吸净。5.吸取1ml培养基于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。6.取2或3个高压后的新培养瓶，瓶口在洒精灯上消蠹2-3次，旋开后分别再 次消蠹瓶口和瓶盖2-3次分别放于洒精灯两侧，然后将细胞培养基均匀的分到3或4个培养瓶内注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用，进行1传3或1传4的培养。7.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在洒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于洒精灯上

9、灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基悬:空移入每个培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在洒精灯上 消蠹2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。8.将培养基瓶口和瓶盖消蠹2-3次后拧紧，熄灭洒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。9.将培养瓶放于28C ,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%即可进 行细胞的传代或保株。四、细胞株的保存1.紫外消蠹30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用洒精消蠹操作 者的双手。

10、2.将所需的培养基，胰酶确保瓶身十净后放于工作台面内，点燃洒精灯，将培养基和胰酶瓶口用洒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在洒精灯上消蠹2-3次，旋开瓶盖后再次分别消蠹瓶口和瓶盖，分别放于洒精灯的两侧。特别是将培 养基瓶放于斜架上，瓶口对准洒精灯，且放在距离洒精灯最近的位置，瓶盖 置于洒精灯的另一侧。3.将培养瓶瓶口在洒精灯上消蠹2-3次，旋开后分别再次消蠹瓶口和瓶盖2-3次，盖放于洒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬:空倒进污缸，在洒精灯消蠹2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在洒精灯上消蠹1-2次，然 后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。4.将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，

11、计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。假设看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；假设看不到针孔 样缝隙和细胞脱落，那么需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况， 可反复几次，直至出现针孔样缝隙 和1-2个细胞脱落的最正确消化状态。用移液器将胰酶吸净。5.吸取1ml细胞冻存液于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。6.将1ml含有细胞的冻存液移入新的保种管内，拧紧瓶盖，做

12、好实验标记。7.将培养基瓶口和瓶盖消蠹2-3次后拧紧，熄灭洒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将保种管先放于4C冰箱30min后拿出放置-20 C冰箱过夜，次日再放于-80 C的冰箱内3-4天，最后存放于-196 C的液氮灌内长期保存。注此过程也可简化因实际操作过程中经验所得：步骤7结束后将保种管用十 脱脂棉包裹后胶带封好直接放于-80C冰箱内4-5天，即可放于液氮灌保存。 但-80 C冰箱也可保存细胞株2-3月。五、细胞转染操作前：紫外消蠹30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用洒精消蠹 操作者的双手。1.预混液A fugeneHD 5ul/?L +

13、OPTI-MEM 45ul/孑L室温温育10min2.预混液B arr 16ul/孔+ OPTI-MEM 34ul/孑L室温温育5min3.预混液C空载16ul/孔+ OPTI-MEM 34ul/孔 室温温育5min4.预混液D arr 12ul/孔+ ops 12ul/孔+ OPTI-MEM 26ul孔室温温育5min注：fugeneHD为转染试剂，arr,空载，ops为棋板？OPTI-MEM为空培养基5.将步骤2,3,4中的预混液B,C,D中分别参加步骤1中的等体积的预混液A,轻 柔混匀，室温温育15min,再次轻柔混匀后室温温育15min。6.取出6孔培养板，将每培养孔的培养基全部吸净，无残留，是为了防止残留 的双抗和胎牛血活影响转染效果。参加