PCR产物胶回收试验

1、实验六PCR产物胶回收实验一、实验目的1 .掌握胶回收的常规操作2 . 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化 PCR产物。本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度W3% ,高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%55% , 0.110kbDNA 片段回收率最大为 99% ,大于10kbDNA片段回收率为 2070%。回收的基因组 DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学 实验。三、试剂及配套设备和材料3.1试剂Extrac

2、tion buffer Wash bufferElution buffer3 .2配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头离心机无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc （pH 5.0）四、基本技术参数提取方法操作时间离心柱溶剂提取DNA片段范围洗脱液回收 率"Mt离心柱16分钟内完成2个样本750ul60bp23kb>99%取大400mg 凝胶条适用琼脂糖种类适用电泳缓冲液温育温度高/低熔点琼脂糖TAE/TBE缓冲液50 C （低熔点琼脂糖）55 C （普通琼脂糖）五、操作步骤1.用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入 1.5或2

3、.0 ml离心管中。请尽量切去不包含 DNA片段的凝胶。一般情况下，电泳的 DNA上样量A50 ul （50ul为最终洗脱体积）。2 .按1 : 3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入 Extraction buffer <例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer 。对于每人份试剂用量，凝胶 质量不能超过400mg。3 .于恒温水浴或金属浴中 50 C温育，直到凝胶融化。一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔 2-3分钟混匀一次。如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入 10 ul 3M KAc （pH 5.0）,使混合液颜色变回黄色。4 .可选：按

4、1:1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混 合均匀。如DNA片段大于500bp/小于4kb,不需要加异丙醇。5 .将混合液全部转移到 Spin column 内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内 液体。如混合液体积大于750ul可先车移750ul ,其余的液体待离心弃液后，再转移。6 .向 Spin column 内加 500ul Extraction Buffer，于 12 , 000g 离心 3060 秒, 并弃去接液管内液体。7 .向 Spin column 内力口 750ul Wash Buffer ，于 12 , 000g 离心 3060 秒，并弃 去接

5、液管内液体。如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置25分钟，再离心。8 .再次于12,000 rpm 离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。9 .向Spin column 内加50ul曰ution Buffer 、水或TE溶液，并于室温静置 1分钟。可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。但不要低于20ul。10 .于12 , 000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于20 Co六、注意事项1 .为了保证没有外源 DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理 干净，刀片最好洗净灭菌。2 .为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂 引起的一些后续麻烦。3 .在洗脱前，将洗脱液于