LIFECODESHLA-LMX试剂盒说明书详

1、LIFECODES HLA-LMX 试剂盒说明书使用目的LuminexHLA I II概要和说明人类白细胞抗原（HLA）是一组免疫系统中通过多态性表现功能性的糖蛋白,在人类免疫系统中起着重要的作用。然而，作为一个高度多态性的系统，HLA分子可以成为在妊娠、输血的血或器官移植后排斥反应的过程中产生的抗体反应的目标。通常，同种异体移植会导致大约33%的个体产生 HLA抗体。这些特异性抗体对移植物的存活起着重要的影响。LIFECODES Lifescreen Deluxe Beads 包被了 HLA I类和II类不同的重组抗原，用来确定待测血清中存在HLA I类和II类的特异性抗体。将待测血清与包被

2、了特异T抗原的微珠加入到Millipore微孔板中，经过30min孵育，若血清中存在 HLA抗体则可与微珠上的抗原结合，利用抽真空方法洗涤除去没有结合的抗体或其他杂质，再加入PE标记的二抗染色，孵育后，通过Luminex平台获取特异性结合微珠的荧光信号，再利用软件分析得到特异性抗原类型。A确认628215: |LMX | LIFECODES Lifescreen Deluxe （96 人份）1. LmXB LifeScreen Deluxe Bead （480科L）含有包被 HLA I类和II类不同抗原的微珠及 4个control微珠， 该微珠存储的磷酸盐缓冲液包含有NaCl, Tween-2

3、0,叠氮钠和牛血清。28c避光保存，非避光条件下暴露不得超过三小时。2. MCJS Conjugate Concentrate （550科L） PE标记的山羊-抗-人IgG 二抗存储的磷酸盐缓冲液包含有 NaCl, Tween-20和叠氮钠。|DIL |使用时用 Wash Buffer1:10稀释。28c避光保存，不得长时间在非避光条件下暴露。3. ILMWB |Wash Buffer （150 mL）：磷酸盐缓冲液包含 NaCl, Tween-20和叠氮钠。28 c保存，在使用之前 平衡到室温（2024 C ）。4. LMPC | Positive Control Serum （80科L眩血

4、清是由多个血清混合而成的，能够与大多数LMX微珠反应。血清中含有叠氮钠，28 C保存。5. LMNC Negative Control Serum （80科L垓血清是由多个不含有HLA抗体的血清混合而成的，不与LMX微珠反应。血清中含有叠氮钠，28 c保存。B警告或注意事项1 .仅用于体外诊断试剂使用2 .替换提供系统内的其他成分，可能会导致错误的结果。3 .细菌污染的样品或免疫复合物的存在，或其他免疫球蛋白聚集可引起增加的非特异性结合和错误的结果。4 .本产品不能检测IgA和IgM。5 .本产品是根据与 Luminex配合使用而设计。6 .所有使用完毕的材料要按照要求处理。7 .有关其他信息

5、请参阅材料安全。C储存方法1 .参阅试剂盒组分包装所标记的储存条件。2 . LMXB和LMCJS光敏感，避光保存，勿冷冻。D使用要求1. LMCJS I Conjugate Concentrate :恒使用时用 Wash Buffer1:10 稀释。28c避光保存，不得长时间在 非避光条件下暴露。2. LMWB | Wash Buffer ：使用之前平衡到室温（2024 C ）。E不稳定因素1 .不要使用浑浊或者过期的组分和控制试剂。2 .未使用完的稀释过的阴阳性对照和二抗均需扔掉，不能留着下次使用。Luminex仪器和 XY平台。VI样本收集和制备血液在无菌条件下收集,新鲜时进行分离操作,以

6、避免因为不适当的存储条件导致假阳性、假阴性反应或者样本污染。血清在 28c不能超过48小时。如果需要存储超过48小时，则应该在-20C以下温度保存或-80 C存储两年以上。血清应该分离红细胞后进行存储和运输。避免反复冻融。不要使用微生物污染，溶血，脂血，或热灭活血清，因为这些样品可能会产生不一致的相应结果。使用前血清样本用 Vortex充分混合30s,然后800012000转离心45min。A试剂盒提供的材料HLA BeadsNegative Control SerumConjugate ConcentrateRecording SheetWash BufferPlate Format She

7、etPositive Control SerumB另行提供的其它材料（试剂盒未提供）5心50 L可调节单道移液器及相应的灭菌Tip头Vortex和平板振荡器300人可调节多道移液器及相应的灭菌Tip头、加样槽Millipore过滤板1.5-2.0mL离心管真空泵试管（为患者或者控制样本准备）封板膜计时器Luminex 鞘液记号笔Luminex校准珠去离子水微型离心机注意：避免 Wash Buffer和Conjugate Concentrate试剂被污染。如果这些试剂被人血清污染，则其会与 anti-Human IgG反应造成结果失败。控制真空压力，压力过强会使珠子与膜粘连无法悬浮，从而导致Lu

8、minex读珠子数失败。向过滤板加液时注意不要用枪头碰触过滤膜，避免过滤膜被捅破。孵育的时候要保证珠子不要被甩到溅出或者黏在两侧孔壁上。如果第一次实验，不确定震荡效果，可以加入几个阳性或阴性对照，确保摸索到最佳的振荡或旋转速度。无论是过量的血清还是洗涤不彻底，都可能降低对检测结合到珠子上IgG的分析能力，导致错误结果。建议每次实验需要加入阳性或者阴性血清，以帮助确定是否是技术错误还是试剂变质导致错误结果。1 .从冰箱里拿出 LMX微珠并将其置于室温条件下避光处解冻，然后将放在冰上避光。注意：微珠可以反复冻融冻结和解冻至少6次，而不会影响其性能。2 .将Wash Buffer置于室温，将待测血清

9、和阴阳性指控血清编号排列，按照 millipore反应孔相对应的位置 填写Plate Format Sheet,使加样的顺序与 Plate Format Sheet格局相一致。3 .用封板膜贴住未使用的Millipore反应孔，在反应孔中加入100山-300山ddH2O润湿滤膜，2-5min后用真空泵抽掉ddH2O。4 .将LMX beads低速离心数秒，收集管冒和管壁上的混合液，vortex 1 min使微珠充分混匀。5 .每个反应孔加入 40山Wash Buffer, 12.5 L待测血清或阴阳性对照血清。每孔加入5Deluxe Bead。每两分钟震荡一次珠子，保证珠子悬浮。注意：务必充分

10、混匀微珠，以保证每个反应孔都加入足够的微珠，否则会影响上机读板的时间以及结果 的判读。6 .盖上封板膜，用锡纸包严反应板，使用平板震荡器室温孵育30min。将未使用的对照血清和Beads放回至2c8c避光储存。7 .用Wash Buffer 1:9稀释二抗(5比二抗加45山Wash Buffer),为了弥补加样误差， 每次多配制一个反应。 二抗稀释好后，避光放置，并将未使用的二抗溶液放回至2c8c避光存储。8 .步骤6结束后，揭开封板膜，每反应孔加入100山Wash Buffer, vortex小心混匀后用真空泵抽掉液体。注意：真空泵的压力不要太大，否则会导致珠子吸附至膜上无法悬浮导致微珠读数

11、失败。抽真空时，使 用的压力大小以能够使孔内液体下降较缓慢为宜。9 .每孔加入250山Wash Buffer, vortex小心混匀后用真空泵抽掉液体。此步骤重复三次。注意：洗涤不充分，会降低二抗与微珠上结合的IgG的结合能力，导致假阴性结果。10 .每孔加50 ML稀释的二抗，盖上封板膜，用锡纸包严反应板，使用平板震荡器室温孵育30min。11 .每孔加130150山Wash Buffer ,小心vortex重悬微珠。使用完毕后，可将剩余未使用的Wash Buffer放入2c8c保存。12 .上机读板。注意：建议在3h之内进行上机操作，否则会增加假阳性和假阴性的可能。质量控制产品包含一个阳性

12、对照一个阴性对照,对照血清应该在每一次实验都设立,用以帮助确定是技术错误还是试剂失效导致检测结果出错。阳性对照血清可以与 HLA Class I (PROBE I-01)和Class II (PROBE II-01)反应结合并具给出最低10000的MFI值。阴性对照血清没有HLA Class I和HLA Class II抗体。如果这些控制血清没有达到这些标准，那么试剂的结合程度和分析都可能受到影响。另外，还包含 3个阴性对照珠子CON和一个阳性珠子Probe 77。CON珠子在分析中计算背景，用于使HLA珠子信号标准化。这些珠子会显示最低MFI值，数值超过检测范围的需仔细检查实验流程。阳性对照

13、珠子Probe 77包被Human-IgG ,能够与LMCJS结合。当检测包含任一对照血清，Probe 77的MFI值将会10000。如果获得值未达到10000 MFI,则可能是未充分清洗或者结合不充分而影响的结果。患者样本将会给一个更宽泛的范围，3500MFI o血清不足情况下，如果其余珠子平均值大约50 MFI或更少时，Probe 77会给出强烈的信号。结果分析MFIMFI ,BAF。 BAF/CON合白M MFI比率，用以莫不由于珠变化导致的背景干扰。试剂盒附带的Recording Sheet 会提供 BAF 值。例如:(individual Bead MFI(individual Be

14、ad MFI(individual Bead MFICON1 MFI)-BAF=Adjusted Ratio 1CON2 MFI)-BAF=Adjusted Ratio 2CON3 MFI)-BAF=Adjusted Ratio 3对于Probe I-01和Probe II-01 ,任一个计算得到的正值结果确定一个阳性珠反应。对于其他珠子，至少有任意两个计算结果为正值则确定一个阳性珠反应。如果三个珠子都是负值则确定一个阴性珠反应。评估检测样本七个Class I HLA珠子，至少有一个判为阳性珠反应，则样本对HLA-I类特异性抗体反应判定为阳性。五个Class II HLA珠子，至少有一个判为阳性珠反应， 则样本对HLA-II类特异性抗体反应可定为阳性。所有HLA珠子均为阴性珠反应，则样本对HLA特异性IgG抗体反应被判定为阴性。该试验结果不能作为临床判断的唯一标准。错误的结果可能是由于细菌污染实验材料，孵育时间不足，洗涤不充分，珠子或LMCJS长期曝光造成检测信号异常，或者漏加试剂与漏掉个别实验步骤。患者样本中存在的免疫复合物或者其他免疫球蛋白聚集体，可能会导致非特异性