整理单克隆抗体技术

1、第十章单克隆抗体技术(Monoclonal antibody technique )原理B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异 性抗体的水平.B细胞的这种水平和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此 产生免疫球蛋白的水平也是极其微小的.将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限 生长的水平,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的水平,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技 术即称为单克隆抗体技术.制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或

2、胸腺嘧啶核苷酸酶 的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合.采用 HAT选择性培养基培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H,氨基喋呤 Aminoopterin A 及胸腺嘧啶核苷 Thymidine T ,在 这种选择性培养基中,由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧 啶核苷激酶,所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA.而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA,这一途径又被氨基喋呤所阻断,所以未融合的瘤细胞不可预防也要死亡.融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤 磷酸核糖转化酶,可以通过次黄嘌呤合成DNA,克服氨基喋呤的阻断,因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选

3、出来.B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长,一般于二周内均死亡.单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：单一特异性,与一个抗原决定簇反 应； 可重复性,能够提供完全一样的抗体制剂；一经制出,可无限量地供给； 生产单克隆抗体,不一定需要纯的抗原；能查出混合物中存在的用常规方法查 不出的少量成分.单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比拟,见表10-1.表10-1 单克隆抗体与常规抗血清的性质比拟性 质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少卩g/ml多 mg/ml无关的Ig多少或几乎无其它血清蛋白有少,培养物上清常有10%胎牛血清Ag-Ab结合免疫原的全部成分的全部免疫原中的一种成分的抗原决定簇一个抗原决定簇特异

4、性亲和力的重复性与其它抗原的交叉反响不同批号间有变化无变化& ft r"力+ 人 K r 丨-4-Uv-l-t与带有共同抗原决疋族的般无.结到共同决定抗原有局部交叉簇那么是完全的免疫球蛋白的种类与亚类完全是混合的只是一种或几种免疫球蛋白的物理性质典型光谱抗体的单一性质二、动物的选择与免疫一动物的选择目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好.就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广,由于所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来.Balb/c系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以 812周龄为宜.大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体.现在已经在小鼠杂交瘤的根底上, 开

5、展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人杂交瘤技术.二免疫一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原.免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一.正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞,一只纯种小白鼠估计能产生1.0X 1075.0X 107种不同的抗体.因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓 瘤融合,只能有千万分之一的时机获得某一种特定抗体.所以为了提升得到某种杂 交瘤的时机,必须增强免疫,使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加.B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响.有人认为处在转 化时期的B淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后78天,虽然是

6、抗体产生的顶峰时期,但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少.故一般认为增强免疫后的第三 天应杀鼠取脾做细胞融合.1. 可溶性抗原蛋白质以1mg/ml5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为 0.3ml0.6ml,间隔35周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验.一个月 后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml0.4ml ,34天后,杀死小鼠取脾做融合用.2 颗粒性抗原如抗原来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间.例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0 .2 ml,每周2次,共免疫58次,取脾前3天

7、,再免疫一次即可.有人认为最后一次免疫剂量要大,大到 近于免疫耐受的程度更好.三、细胞的选择(一) 脾细胞1材料(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠.(2) 1640 培养液(3) 2.5% FCS1640 营养液2操作方法(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠.(2) 将小鼠放于 70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.(3) 把脾放入5ml含有2.5% FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4) 用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5) 直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中.(6) 以 2.5%F

8、CS1640 充满离心管,并以 400g 离心 7min10min (与此同时 应开始制备骨髓细胞).(7) 把沉淀用约 10ml 的新鲜培养液再悬浮.(8) 重复、步骤.(9) 计算细胞, 以台盼兰染色用相差显微镜检查, 活细胞数应高于 80%为合格.(二) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响 或降低所分泌抗体的滴度, 所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞.选择骨髓瘤细胞的条件： 该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系, 以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生丫球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个

9、较高的细胞密度,最好106个细胞/ml ;生长速度快,繁殖时间短.目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXO BU 1 ,SP2/ 0Ag14 (简称 SP2): P2 X ？ Ag8 6 5 3 (简称 653 ); FO以653最为常用,它是由矿物油 4甲基15烷(Pristane,降植烷)诱发出来 的一种浆细胞瘤( Minerol Oil plasmacy toma , MOPC )并经过培育形成一株 8-氮鸟 嘌呤有反抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195 C液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此

10、不需要胰酶处理.为了预防出现返祖现象,在融合前,可将培养基内参加 15卩g/ml 8 氮鸟嘌呤.取约1 x 107 6X 107对数生长期(即培养 15h20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g) 10min , 沉淀以2.5% FCS1640液再悬浮并计数.(三) 饲养细胞 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须参加其 它活的细胞才能使其生长繁殖,参加的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell).在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的根底上使其生长繁殖成群 体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞. 许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞, 如正常的脾细

11、胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是 巨噬细胞和淋巴细胞.应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞,另一方面 巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹 腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠.也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1 材料(1) 小鼠(Balb/c或C57小白鼠)假设干只.(2) 11.6%蔗糖溶液(经 10磅30min高压灭菌).2操作方法( 1)拉颈处死小鼠.(2) 70 %酒精浸泡消毒 10min.( 3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.(4) 用注射器将 4ml 11.6%蔗糖溶液注入

12、腹腔,用手指轻揉 1min 仍用该注射 器回抽腹腔液体,参加离心管.(5) 1 000rmin 离心 10min.( 6)取上清,以 HAT 选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞, 使每毫升含 40 万个活细胞.7以 1ml 吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml ,含 2 万个细胞,放入CO2 培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中饲 养细胞数量少,那么可以在细胞换液时再参加一些.四、细胞融合一融合剂 细胞融合的方法有物理法,如电融合、激光融合,化学融合法和生物融合法, 如仙台病毒,此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法.聚乙二醇PEG,在分子量

13、为200700时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分 子量大于 1 000 时,呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对 热稳定,与许多化学药品不起作用.用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为 4 000者,常用浓度为 50, pH8.0pH8.2 用 10 NaHCO 3调整 ,分子量小的 PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,那么粘性太大,不易操作.50%浓度,pH 偏碱时融合效应最高.也有采用30%50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜.不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意.每批都必须进行细胞毒性试验前方可应用.要买高纯度的,一般选供气相色谱

14、用的PEG.二融合过程融合的方法很多,常用的有转动法和离心法.融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为 1:1至10:1不等. 3:1或5:1最为常用.1 试剂与材料1供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞.21640 培养液 100ml.3完全 1640 液 100ml. 2.5 % FCS 1640 液 50ml.5HAT 培养液 100ml.650 % PEG :取分子量 4 000,高纯度的日本进口或 Serva PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌,使用前用预热于40C的1640液10ml等量W/V 混合,以酚红检查pH,一般不必调pH.如pH有改变,可用 HCI或NaHCOs调整.710ml 和 5

15、0ml 的灭菌沉淀管或瓶.(8) 40 孔塑料培养盘.2操作方法 准备好脾细胞. 在 50ml 沉淀管中混合 108 脾细胞和 107 小鼠骨髓瘤细胞,并参加 50ml 2.5 FCS1640 液. 室温 400g 离心 3min ,使细胞沉淀. 移去上清液. 轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于40 C水浴中,使其达融合温度.加预热至40C的50% PEG 0.8ml,用1ml吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续 2min . 加 1ml1640 液,边加边摇动,持续 1min.重复一次. 加1ml 1640液,边加边摇动,持续 0.5min. 重复一次.(

16、11) 加 1640 液 15ml.(12) 室温,400g离心1min,使细胞沉淀.(13) 去上清,轻敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液.往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔1 滴(约 0.05ml).(15) 轻摇后,放入5% CO2饱和湿度的37C温箱中培育.(16) 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液.注意轻轻吸取上清液, 勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要参加适量的饲养细胞.(17) 于第12、15日参加含有HAT的完全1640培养液.在每次换液前用倒置显 微镜观察, 大约在 10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来. 大多

17、数杂交瘤细胞在 1020 天内出现,但也有在 1 个月左右才能出现的.杂交瘤细胞出现后,吸取上清 液,检查抗体.(18) 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代.在传代过程中,依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS 1640液.同时保存于液氮和进行克隆化, 在这 期间每代都要检查抗体,以预防产生抗体细胞的变异和丧失.(三) 细胞融合的关键1 技术上的误差常常导致融合的失败. 例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答. 这必然要失败的.2. 融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术.五、抗体检测及杂交瘤细胞的选择(一) 抗体检测 用检测抗体的

18、方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的.检 测抗体的方法很多,从沉淀反响到放射免疫测定.由于细胞培养液中的抗体浓度通 常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反响.杂交瘤 产生的抗体那么是单克隆的,所以并不是每项方法都能适用.一定要选择敏感的、快 速的、一次又能检测多份样品的方法.常用的检测方法如下：1. 试管溶血反响检测法(1) 材料：杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液；绵羊红血球,洗涤三次后,配成1 %悬液；豚鼠补体,无菌采取补体,以 pH7.2PBS稀释成20% 溶液,分装小瓶,于-40C保存.使用时以补体和压积红血球 5:1 (V/V )的量进行

19、吸收,4 C 30min ,然后2 OOOr/min离心10min ,去红血球,取上清液备用；0.01Mol/L pH7.2PBS 液.(2) 操作方法：在小试管中,参加0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再参加 0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度；参加 0.1ml补体和1%绵 羊红血球0.1ml,混匀后置37C水浴1h；观察结果,以绵羊红血球完全溶解的杂 交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价.2. 斑点检测法抗红血球外表的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合, 进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定.(1) 材料：绵羊红血球,处理同试管法,最后配

20、成25%红血球悬液；新 鲜豚鼠血清(同试管法处理)；琼脂糖,配成0.6% PBS液,水浴中溶化；0.01MOI/L PH7.2PBS液；兔抗羊红血球抗体.(2) 操作方法：将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45C48 C水浴中；加0.1ml 25 %红血球悬液,0.1ml豚鼠补体,迅速混匀,倾注一干净载玻片上； 凝固后,在凝胶外表固定区域滴加2ml待测样品,标准阳性血清和对照试液；待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘；37 C温育1h2h,观察并判定结果.强阳性( +)中等阳性( +)弱阳性(+)阴性(-)必要时可置室温过夜,再判定一次.3. 膜荧光检测法(1) 材料：培养液HEM或RPMI -

21、1640;荧光试剂：异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的抗小鼠免疫球蛋白； 50%甘油缓冲液：1份甘油加1份体积0.05MOI/L pH 7.2 PBS液混合即成；荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等.(2) 操作方法：用培养液洗涤二次细胞,悬浮成 2.0 X 107/ml :50 pl细胞悬液加50 p l培养上清液混合,置 4 C 30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min离心； 以50/FITC 抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min60min ;用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮；取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖片,用甘油缓 冲液封固,置荧光显微镜下观察.着色细胞也可以在固定后

22、观察,一滴细胞悬液,涂片、风干,用95%酒精固定10min,固定后的载玻片用 PBS洗涤,盖上盖玻片, 进行观察.4免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测以琼脂双扩散试验法进行, 此法简单易操作,特异性好.注意必须将培养液浓缩1050倍,否那么做双向琼扩不出现沉淀线.其检测方法为：(1) 制备各种兔抗小鼠IgGz、lgM12、IgA 12和K、入抗血清,也可直接购置.( 2)取 5ml 培养物的上清液缓慢参加 0.5ml 的饱和硫酸铵溶液,混匀,静置 3h,离心沉淀,去上清,沉淀加 0.05ml蒸馏水溶解.(3) 制成1%琼脂糖凝胶板,打孔.中间孔加20卩l浓缩上清液,周围孔加20认 特异性抗血清,以

23、10p l 正常小鼠血清作对照.也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测.(二) 杂交瘤细胞的选择经HAT选择培养基培养1014天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交 瘤细胞即可逐渐长成细胞集落.停用 HAT 液后,改用 HT 培养基.当细胞集落面积 超过培养孔的 1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔.连续三次检 测逐渐升高或维持在同一水平者,那么可以做克隆化,一局部那么冷藏起来做长期保种 用.六、克隆化经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分 泌单克隆抗体.克隆的时间一般说来越早越好.由于在这个时期各种杂交瘤细胞同 时旺盛生长

24、, 互相争夺营养和空间, 而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能. 但克隆时间也不宜太早,太早细胞性状不稳定,数量少也易丧失.克隆化的阳性杂交瘤细胞,经过一段时期培养之后,也还会由于细胞突变或特定染色体的丧失,使局部细胞丧失产生抗体的水平,所以需要再次或屡次克隆化培 养.克隆化次数的多少由分泌水平强弱和抗原的免疫性强弱而决定.一般说,免疫 性强的抗原克隆次数可少一些,但至少要35次克隆才能稳定.克隆化的方法很多,包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活 别离法等.(一) 有限稀释法1材料( 1)微量培养盘,盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞(即饲养细胞) 每孔 2 万 4 万.

25、( 2) HT 培养基2操作方法( 1)取出抗体阳性孔细胞,用 HT 培养液制成细胞悬液.并取样进行台盼兰染 色,计数.(2) 用HT培养液将细胞稀释成 200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液.(3) 用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘,每孔0.05ml,细胞含量分别为 10个/孔、 2个/孔、 1个/孔和 0.5个/孔.(4) 5%CO2饱和湿度,37C培养.( 5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况,选择只有一个集落生长的孔, 弃掉两个以上和没有细胞生长的孔.( 6)克隆大量繁殖后,布满孔底的1/3 1/2 时,测培养液抗体.(7)抗体阳性孔细胞,移到有饲养层的组织培养瓶中,并传

26、24代就可以脱离饲养细胞,建成克隆株.(二) 软琼脂克隆化 借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长,而到达克隆化,具体操作如下：1. 配2.5%的琼脂糖30ml,水浴溶化后,移入 45C水浴中.2. 将117ml完全DMEM 液和3ml 10倍浓度的DMEM 液混合,置45C水浴预 热.3. 将琼脂糖与 DMEM 液混合, 即为含 0.5%琼脂糖的完全 DMEM 液, 并加 75 X 108脾细胞.4. 每块平皿加10ml,于室温中凝固.5. DMEM中的细胞与DMEM 琼脂1:1混合,将细胞琼脂混合物 2ml铺于凝 固的平板上,使其全部覆盖.6. 放入CO2箱饱和湿度,37 C培养10天.7. 用

27、PBS配制0.6%琼脂糖,于沸水浴溶解后,置45C,在保温情况下取一试管,迅速参加 0.1ml 25羊红血球, 0.2ml 豚鼠补体, 2.7ml 0.6 琼脂糖.8. 用3ml琼脂糖一羊红血球混合液覆盖克隆.于37 C CO2箱孵育1h2h.从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围,可筛选抗羊红血球Ig .三显微镜操作法在直径6cm培养皿中,参加1ml 1.0 x 108细胞悬液放置5 % CO?饱和湿度,37 C温箱中放置30min以上,倒置显微镜下,寻找那些与周围相距甚远的单个细胞, 将毛细管口一头有直角弯头毛细管,一头连接一尺长乳胶管,用口限制液体进入 水平置放于液面上,左右微动,直到看见管口

28、,对准细胞,吸入毛细管,将管中细 胞移到预先加有2.0X 1045.0X 104饲养细胞96孔板内,培养后,即可获得单个细胞 形成的克隆.四荧光激活别离法用一种荧光激活细胞分类器 Fluorescein Activafed Cell Sorter , FACS .其基 本原理是：将细胞经荧光抗体染色后,经喷嘴形成单个细胞的线形液滴,在莱塞光 激发下,荧光素发射荧光,此信号由光电倍增管接收,再结合细胞形态大小产生光 散射信号,经电脑处理,产生信号并与预定的信号比照,根据细胞荧光强度及细胞 大小不同,将细胞分成不同级别,在电场中发生偏离,而分别收集于不同容器中.七、单克隆抗体的制备一杂交瘤细胞的大

29、量繁殖 克隆化的细胞可以在体外进行大量培养,收集上清液而获得大量的单一的克隆 化抗体.不过体外培养法得到的单克隆抗体有限,其不能超过特定的细胞浓度,且 每天要换培养液.而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制.杂交瘤细胞具有从亲 代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性.如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排 斥杂交瘤的小鼠无胸腺的裸鼠,杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿主死亡. 产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,这种 抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 1001 000倍.利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进 肿瘤的生长.1 .材料 1

30、经高压灭菌的降植烷.2Balb/c 鼠：58周龄.3杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞.(4) RPMI 1640 培养液(5) 新生牛血清2操作方法(1) 于小鼠腹腔注射 0.5ml降植烷,注射后19周内种植细胞.(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5%FCS1640液洗涤一次,1 000r/min离心 10min .(3) 取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5% FCS1640液配成1.0X 107细胞 /ml 的悬液. 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml (含1.0X 107个细胞 /ml ).(5) 接种后 10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔

31、 13天 取 1 次,可取 10次.血清可由腋下动脉或心脏采血后别离.(二)单克隆抗体的提纯1 材料(1) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.87.9Tris HCl 缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE 纤维素柱 2操作方法5(1) 小鼠腹水用冷 PBS液稀释4倍后,于1.00 X 10转离心30min,去沉淀.(2)

32、 在4 C于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50 %硫酸铵浓度.(3) 此溶液置冰中 30min60min,然后5 000r/min离心10min,去上清.(4) 将沉淀溶于 TrisHCl 缓冲液( 40mMol/L NaCl )中(溶液可能混浊).(5) 装入透析袋于 TrisHCl 缓冲液( 20 mMol/L NaCl )中透析除盐. ( 6)离心去沉淀.(7) 溶液稀释(1: 100或更高倍稀释)后,于 280nm测蛋白含量,估计蛋白质含量1A 280unit=0.8mg 蛋白质A280unitsA2S0unils mgl 或=14一般每ml腹水中,含有总蛋白约

33、25mg36mg.8过DEAE 纤维素柱：纤维素柱高 40cm,以20mMol/L NaCI Tris 缓冲液 平衡.透析样品以 Tris缓冲液等量稀释.样品进入柱床速度为1ml2ml/min,以NaCI线形梯度洗脱.大局部单克隆 IgG 于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于 120 mMol/L 150 mMol/L NaCl 洗脱.测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用.杂交瘤产生各种免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪种为主,那么决定于抗原的免疫程序.免疫一次,且3天后就取脾,多为产生 IgM的B淋巴细胞.免疫屡次的多为IgG

34、.三单克隆抗体的鉴定1 杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行.2单克隆抗体的类型、亚型的测定：购置兔抗小鼠lg类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型.3. 单抗的特异性鉴定可以采用各种方法,如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等.4. 单抗的效价测定可采用凝集反响、ELISA或放射免疫测定.不同的测定方 法效价不同.培养上清液的效价远不如腹水的效价.采用凝集反响,腹水效价可达5X 104.而采用ELISA检查,腹水效价可达 1.0X 106.单抗的效价以培养上清和腹 水的稀释度表示.5. 必要时还可以测定

35、单抗的亲和力和识别抗原表位的水平测定.八、杂交瘤细胞的保存一保存当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,必须将一局部杂交瘤细胞保存,否那么在连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丧失 产生抗体的特性.另外在长期的培养过程中,难免不发生污染以至于消灭.所以必 须冷藏保存一局部.保存方法如下：1材料(1) 细胞：取对数生长期的细胞.(2) 10 二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器,而又被高压所破坏,所以 不能过滤或高压消毒.其本身就是毒品,无菌)：含10二甲基亚砜、 20灭活胎牛血清, 70RPMI 1640 液.(3) 20 % FCS 1640培养液：含青霉素 1

36、00U/ml,链霉素100卩g/ml.(4) 灭菌的 2ml 安瓶等2操作方法(1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液,参加10% FCS1640液,使细胞悬浮.(3) 1 000r/min离心10min,去上清.细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液,使成1.0 x 107细胞/ ml.(3) 取样,台盼兰染色,计数活细胞,应在 95%以上.(4) 用注射器将细胞分装安瓶,每瓶 0.5ml1.0ml,熔封安瓶.(5) 放 4C 2h.(6) 放液氮罐气态局部(-70 C) 15h.(7) 转入液氮局部.(二)复苏1 从液氮罐中取出安瓶立即放37 C水浴中速溶.2无菌操作翻开安瓶,取出细胞悬液,转

37、入组织培养瓶.3逐滴缓慢参加 20% FCS- 1640培养液3.5ml,这个过程延续 3min.4. 5% CO2饱和湿度,37C培养.5. 4h后弃去培养液上清,参加新鲜的20% FCS- 1640培养液.6. 继续培养,换液,以至形成单层.九、试剂配制1. RPMI - 1640 培养液 取 1640 粉 10.5g 加水 1 000ml 加温溶解 (不要超过 50C立即用G6漏斗过滤,分装,冰冻保存.2 DMEM 培养液13.38g干粉溶于1 000ml水中,并加以下试剂:0.11g3.60g20 万 U20 万 U丙酮酸钠 碳酸氢钠青霉素 链霉素培养液用 CO2 正压除菌过滤, 使变

38、酸呈橙色, 参加 20的新生小牛血清后即可使用,4C保存.3 HAT 培养液DMEM 培养液490ml,力口 HT和A各5ml.100 X HT的配制：次黄嘌呤 H 胸腺嘧啶核苷 T称取次黄嘌呤136.1mg和胸腺嘧啶核苷 38.8mg溶于100ml水,过滤除菌-20避光保存.100X A 的配制：氨基喋呤A:称氨基喋呤 1.8mg溶于20ml水中,加0.5ml 1Mol/L NaOH 助 溶,然后以 0.5ml 1Mol/L HCl 中和,再加水至 100ml.4HT 培养液500mlRPMI 1640 液加 HT 母液 5ml 即可.5. 完全 RPMI 1640 液：RPMI495.0mlHopes 缓冲液1Mol/L 10.5mlL 谷胺酰胺5.0ml抗菌素液5.0ml灭活小牛血清50.0ml6. 以上配试剂用水均为双蒸馏水.十、 马传贫病毒单克隆抗体的制备一材料与方法1抗原动物及免疫方法抗原为哈尔滨兽医研究所保存的马传贫病毒株培养物制备的可溶性抗原. 免疫动物为68周龄的Balb/c鼠.初次免疫用含完全佐剂抗原 0.2ml 病毒含量为1.0X 108/ml制备的可溶性抗原腹腔接种,经2周再次免疫接种,应用不完全佐剂抗原 0.2m