核酸分析(Nucleic aicds)

1、第五章 核酸分析（Nucleic aicds）第一节 基础知识一核酸的基本概念核酸生物大分子线性多聚核苷酸 P444核酸多聚核苷酸 polynucleotide戊糖 + 碱基 磷酸 核糖 Ribose 腺嘌呤Adenine-A 脱氧核糖 鸟嘌呤Guanine-Gdexoyribose 胞嘧啶Cytosine-C 胸腺嘧啶Thymine-T 尿嘧啶Uracil-UDNA 脱氧核糖核酸dexoyribonucleic acidRNA 核糖核酸ribonucleic acid 核酸存在于细胞中，DNA细胞核 RNA细胞质 病毒目前最大分子，电镜下可见，二DNA结构天然DNA右手双螺旋链状结构，碱基（

2、A,T,C,G）互补结合（氢键）（base complementary），遗传信息载体，极重要生物学意义，DNA 复制，转录。反转录 结构：P446糖和磷酸脂化反应形成链的框架糖碱基缩合反应糖苷键 三RNA结构1.结构：线形多聚合苷酸，与DNA结构不同点 戊糖核糖 AGCU-用V尿嘧呤代替胸腺嘧呤 单链线形分子，局部双螺旋，自身回折2.种类：三种核糖体RNA（ribosomal RNA rRNA） 转运RNA（transfer RNA tRNA）在蛋白质合成过程中具有转运AAs的作用信使RNA (messager RNA mRNA) 以DNA为模板又是蛋白质合成模板遗传信息 DNA 转录 mR

3、NA翻译，转译蛋白质模板 transcription translation复制 直接模板replication 每种mRNA 携带从DNA 转录的一种或几种蛋白质编码遗传信息tRNA携带AAs，可确认mRNA 编码DNA结构1953425 Nature 900词 文章 Watson 沃森 (25) 生物学家 Crick 克里克 (35) 物理学家1951秋Watson美国博士后，丹麦哥本哈根，那不勒斯开会，威尔金斯DNA报告英国剑桥大学卡文迪许 实验室威尔金斯，富兰克林，x线衍射，螺旋结构鲍林，化学家 蛋白质-螺旋沃-克：数据； 方法积木 提示氢键 遗传信息的提示碱基互补第二节 核酸提取、分

4、离、纯化提取对象：细胞，组织中染色体，DNA RNA 细菌，质粒 DNA 提取过程： 细胞组织破膜、释放、内容物 分离提取液，除DNA，RNA以外的组分 DNA，RNA浓缩一细胞中DNA提取 细胞组织在裂解液中（Triton X-100和SDS缓冲液） 匀浆溶膜破解提取液 利用蛋白水解酶和核糖核酸酶温育，除去蛋白质和RNA DNA提取，进入乙醇见书P449 （1） 在6 Vols 裂解液中匀浆（2） 除细胞碎片和离心方法（3） 温育，与蛋白酶K 温育（4） CHCL3 3 酚萃取，除蛋白（5） 沉淀核酸 DNA, RNA 乙醇（6） 重新溶解，Tris 核糖核酸酶（7） 沉淀DNA 无水乙醇，

5、离心（8） 溶解另一种分离提取方法CsCL密度梯度离心，超速离心分离蛋白，DNA RNA 原理：密度不同，沉降速度不同方法：超速离心65000转min 6小时 （ 45000转min 36小时） CsCL浓溶液 8mol/L ， 溴乙锭染色，示踪，分离，见书P451 二电泳分离方法 方法，标准技术，琼脂糖电泳，简单快速，分辨率高 原理：电泳中性碱性条件下，磷酸基团带负电荷，移向正极， 凝胶分子筛效应，小快大慢 凝胶孔径大小由琼脂糖浓度决定，0.52% 20050000碱基对 装置： 如图P452，小碱基数（200)DNA片段分离，需采用聚丙烯酰胺凝胶，分离毛细管凝胶电泳，线性凝胶电泳96通道毛

6、细管电泳阵列测序微流控芯片384通道芯片 定位,示踪，DNA标记结合染料，溴乙锭，加入凝胶中ethidium bromide(EtB) 嵌入式荧光染料，插入DNA 碱基对之间结合，紫外光300nm激发棕红色荧光590nm如图P453 回收：凝胶上样品DNA回收常用方法：定位，切割胶块，放入透析袋中，电泳DNA由胶释放，吸附透析膜上，反向通电3060秒钟，DNA回进缓冲液中，苯酚抽提，乙醇沉淀，回收率50%三色谱分离方法HPLC 高效液相色谱，具体：反相色谱：利用不同片段疏水性不同分离50碱基 达到很高分辩率，可分辨一个碱基的差别 相同碱基数，不同碱基组成片段，疏水性 不同 图P454离子交换色

7、谱：利用电荷，尺寸大小，分离大片段， 四核酸的变性、复性及杂交 变性（denaturation） 定义：核酸双螺旋区氢健断裂，变成单链， 不发生链内共价（化学）健断裂， 不发生序列（碱基）的变化， 种类： 温度升高热变性，80100， 酸碱变性 甲醛、尿素 常见变性剂如DNA 稀盐溶液，加热80100双链 部分 无规则线团 分子内碱基配对DNA 解链 温度 ® ® 升高特点：变性，爆发式，很窄温度范围，一般7085之间 开链达到一半时温度，DNA熔点， 熔解温度TM 见P456 复性（renaturation）l 变性DNA在适当条件下，由单链重新结合成双螺旋l 复性方法：

8、 已经热变性DNA骤冷却，不能复性 慢冷却 可复性l 影响因素DNA片段越大，复性难，DNA浓度越高，复性易 核酸的杂交（hybridization）不同来源DNA在同一容器，经历热变性，复性过程， 如异源DNA之某段区域有相同序列，复性时形成杂交DNA 分子第三节 核酸分析方法一紫外分光光度法1原理： 嘌呤，嘧啶含共轭双键 碱基核苷核苷酸核酸， 240290nm有吸收，mxz 260nm2 应用 粗定量，吸收系数法A260nm=1 C双链DNA=50 ug/mL C单链DNA RNA =40 ug/mL 纯度检查A260nm/A280nm=1.8 等于此值，DNA纯度高 大于此值，含RNA杂

9、质 小于此值，含蛋白质杂质RNA A260nm/A280nm=2.0 变性、复性监测变性，A上升，复性，A下降 图P456二化学方法比色法 荧光法 用得不多，不介绍三酶法1 限制性内切酶，Restriction endonucleasesl 1979, W.Arber H.Smith, D,Nathans 发现 存在于细菌中，除解外界侵入DNA，不清除本身DNAl 功能：专一性，识别双链DNA上特定点位，将两条链切断，非常有用，象一把手术刀，l 限制酶识别特定点位48碱基对l 种类350余种l 命名 EcoRI 大肠杆菌属名，种名，菌株，酶编号l 常见内切酶，见表P4592 DNA连接酶 Ligase3 DNA聚合酶 DNA polymerasesl 功能催化与一个已有DNA，RNA单链（模板Template）互补的DNA新链的