SRY基因在性别鉴定中的应用

1、1遗传学实验遗传学实验SRY基因检测及在性别鉴定中的应用2二、实验目的二、实验目的了解SRY基因检测及在性别鉴定中的应用3二、实验原理二、实验原理 性别的发育起始于胚胎第6周， 胚胎的初期是属于中性的。所有的早期胚胎內都存在着两种性腺，外胚胎内存在两套导管，发育成女性的前身苗氏管（Mllerian ducts）发育成男性的前身沃氏管（Wolffian ducts）4SRYSRY基因（基因（sex-related Ysex-related Y） SRYSRY基因（基因（sex-related Ysex-related Y）是人类性别决定基因，定位于）是人类性别决定基因，定位于Yp11.3. Yp

2、11.3. 只含只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb1.1kb，编码一个，编码一个204204氨基酸氨基酸的蛋白质。的蛋白质。 该蛋白的功能是与该蛋白的功能是与DNADNA结合激活抗中肾旁管物质（结合激活抗中肾旁管物质（MISMIS苗氏管抑制物质）苗氏管抑制物质）调节途径，导致调节途径，导致MISMIS表达，使前身苗表达，使前身苗氏管氏管退化，女性生殖系统不能生成，退化，女性生殖系统不能生成，生成睾酮，通过双氢睾酮作用，使胚胎体內的男性的前身沃氏管生成睾酮，通过双氢睾酮作用，使胚胎体內的男性的前身沃氏管（Wolffian ductsWolf

3、fian ducts）发育，生成男性生殖系统。）发育，生成男性生殖系统。5PCRPCR技术原理技术原理 PCRPCR技术是一种体外核酸扩增系统，根据技术是一种体外核酸扩增系统，根据SRYSRY的序列，合成的序列，合成特异引物特异引物，经，经PCRPCR扩增仪的变性、退火和延伸三扩增仪的变性、退火和延伸三个步骤的多次循环，形成与模板链互补的新个步骤的多次循环，形成与模板链互补的新DNADNA链，链，产物长度产物长度300bp300bp左右左右。6Yp11.37基因组DNA的提取磁珠法提取DNA碱裂解法提取DNA1.用NaOH作用20分钟2.加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。1.裂解液/蛋

4、白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶2.基因组DNA选择性吸附于磁珠3.通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，去除细胞代谢物、蛋白等杂质4.用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱 磁珠法提取DNA试剂盒 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。 快速简捷，一般可在36分钟内完成。 不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度，提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.7-1.9， 长度可达2 0 k b - 5 0 k b，可直接用于P C R、Southern-blot和各种酶切反应。8 新鲜植物、动物组织，高温干燥过 DNA破坏

5、比较严重的植物、动物组织，海洋生物，法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点，转基因食品91.样品处理 a.3根含毛囊的毛发 向1.5ml离心管加入380l Buffer MGL和20l Proteinase K，从毛发根部取1cm长的含毛囊的毛发加入上述离心管中。 b.口腔脱落的细胞 2ml唾液或10ml漱口水，2000rpm离心5min,将上清用移液器小心移去，向沉淀加入380l Buffer MGL和20l Proteinase K。10 2.将上述离心管振荡混匀，65 水浴20min，间或混匀，使样品充分裂解。 3.向充分裂解的样品加入400l Buffer MA和10l Magicmag

6、beads,振荡混匀10s. (吸取Magicmag beads之前，先混匀。务必将Magicmag beads加至液面以下） 4.将离心管置于磁力架上，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。 (吸弃上清时，不要吸入Magicmag beads）11 5.加入700l70 %乙醇，振荡混匀10s.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。 6.重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内无残液。 7.加入15-25l TE Buffer, 65 水浴20min，间或混匀,离心2min， 8

7、.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的离心管，即获得jiyinzuDNA.12磁珠法提取DNA131415基因组DNA的提取碱裂解法提取DNA1.用NaOH作用20分钟2.加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。1、毛发样品DNA的制备 （1）男生毛发10根，女生毛发10根作为对照。 也可取一些口腔上皮细胞。 （2）在一个200ul PCR管中加20l的0.2mol/L NaOH溶液。剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上管盖，放入有热盖的PCR仪中， 75温育30min，以避免水分蒸发。 如使用牙签刮取口腔上皮细胞，应注意沾过NaOH

8、溶液的牙签不能再放回口腔，以免烧伤。 （3）加入50l的0.04 mol/L HCl中和。 （4）12000 r/min 离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。 2、PCR反应 （1）扩增人的SRY基因，所用引物为： SRY1: 5-TGG GAC TGG TGA CAA TTG TC-3 SRY2：5-GAG TAC AGG TGT GCA GCT CT-3（2）每个样品反应体系为25l。首先将下列成分预混：10PCR缓冲液 5l 25mM MgCl2 4 l 2.5mmol/L dNTP 4l10 umol/L SRY引物 1 2l10 umol/L SRY

9、引物2 2l1 U/l Taq酶溶液 1lddH2O 26l共44ul。将上述成分混合均匀；分装到2只0.2 ml离心管中（22l/管）；一管加入3l男生DNA，另一管加入3l女生DNA。 （3）PCR反应条件为： 94 3min 94 30s 50 30s 循环35次 72 30s 72 5min 10 3、电泳检测 制备2%的琼脂糖凝胶，取8l PCR产物，加2ul上样缓冲液，混匀，点样，同时点DNA分子量标记，在5V/cm的电压下电泳，电泳结束后用EB染色20min，紫外检测观察并照相。20 2.将上述离心管振荡混匀，65 水浴20min，间或混匀，使样品充分裂解。 3.向充分裂解的样品

10、加入400l Buffer MA和10l Magicmag beads,振荡混匀10s. (吸取Magicmag beads之前，先混匀。务必将Magicmag beads加至液面以下） 4.将离心管置于磁力架上，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。 (吸弃上清时，不要吸入Magicmag beads）21 5.加入700l70 %乙醇，振荡混匀10s.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。 6.重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内无残液。 7.加入15-25l TE Buffer, 65 水浴20min，间或混匀,离心2min， 8.将离心管置于磁力架