作业指导书--抑真菌,抑细菌试验证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查

1、XXX有限公司文件编号XXXPage 1 of 5工作指引名称:抑真菌，抑细菌试验1适用范围适用丁产品无菌检查时操作方法的验证，以证明所采用的方法适合丁该产品的无菌检查.2参考文件2.1ISO11737-2 Sterilization of medical device Microbiological Part2: Tests of sterilityperformed in the definition, validation and maintenance of a sterilization process.2.2ISO 13485 Medical devices Quality man

2、agement systems Requirements for regulatorypurposes2.3中华人民共和国药典2015年版 二部 附录XI H无菌检查法2.4 COP093定义3.1无菌测试test of sterility:灭菌开发，确认或重新确认的一部份，确定产品上是否存在 活微生物的技术操作.3.2抑细菌/抑真菌测试bacteriostasis/fungistasis test:在无菌测试中，选择特定的微生物检定样品中存在的某些物质对特定微生物的抑制作用.3.3样品份额sample item portion（SIP）:从产品上取的用丁测试的规定部分.3.4CFU:菌落形成

3、单位colony-forming unit.4职责4.1实验员:具备微生物方面知识，熟悉测试操作.4.2实验工程师：熟悉测试，指导实验员测试.5指引5.1测试准备5.1.1检测设备a）生物安全柜b）包温培养箱c）细菌过滤器d）高压蒸汽灭菌锅制定：XX碓亏忍:日期:2-Mar-19修言丁版次：2XXX有限公司文件编号XXXPage 2 of 5工作指引名称:抑真菌，抑细菌试验5.1.2检测用品a)稀释液，冲洗液:0.1%蛋白豚水溶液，0.9 %NaCl,PH7.0氯化钠-蛋白豚缓冲液；b)营养肉汤或胰蛋白豚大豆肉汤，胰蛋白豚大豆琼脂培养基，液体硫乙醇酸盐培 养基；c)剪刀,镶子,接种棒，微孔滤膜

4、(0.45 pm);d)洒精灯,75%洒精，培养皿，培养缸/管，试管；5.1.3根据检测需要，按规定要求配制好培养基，稀释液和冲洗液；5.1.4将配制好的培养基，稀释液和冲洗液分装到三角瓶中密封并用白纸包住封口，微孔滤膜用水润湿放入培养血中，剪刀，镶子，接种棒，培养血,培养缸/管,试管,细菌过 滤器不锈钢杯用分别用白纸包好，所有物品经121 C高压蒸气灭菌30min;5.1.5超声活洗机和细菌过滤器用75%洒精擦洗干净；5.1.6实验前两小时打开生物安全柜，阳性对照室，更衣室的紫外灯进行环境消蠹30min，在开启紫外灯时人员必须远离，以免灼伤眼睛和皮肤造成人身伤害；5.1.7所有检测用品，样品

5、由传递窗递入阳性对照室.5.2菌种及菌液制备5.2.1菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633生抱梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC 19404白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10231黑曲9(Aspergillus niger)ATCC 16404大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC 259225.2.2菌液制备a)接种金黄色葡萄球菌，铜绿

6、假单抱菌，枯草芽抱杆菌，大肠埃希菌的新鲜培养 物至营养琼脂培养基上， 接种生抱梭菌的新鲜培养物至液体硫乙醇酸盐培养 基中,3035 C培养1824小时；b)接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基或胰蛋白豚大豆琼脂培 养基上,2328 C培养2448小时；c)上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小丁100cfu的菌悬:液;制定：XX碓亏忍:日期:2-Mar-19修言丁版次：2XXX有限公司文件编号XXXPage 3 of 5工作指引名称:抑真菌，抑细菌试验d）接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基或胰蛋白豚大豆琼脂培养 基斜面上，2328 C培养57天，加入35ml含0.

7、05%吐温80的0.9%无 菌氯化钠溶液，将抱子洗脱，然后用适宜的方法吸出抱子悬液至无菌试管内， 用含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含抱子数小丁100cfu的抱子悬:液；e）菌液制备后若在室温下放置， 应在2小时内使用， 若保存在28 C， 可以24小 时内使用，黑曲霉抱子悬液可保存在28 C，在验证过的贮存期内使用.5.2.3培养基接种a）取每管装量为12ml的液体硫乙醇酸盐培养基9支,分别接种小丁100cfu的 金黄色葡萄球菌，铜绿假单抱菌，生抱梭菌，大肠埃希菌各2支，另1支不接种 作为空白对照，培养3天,逐日观察结果；b）取每管装量为9ml的胰蛋白豚大豆肉汤7支，

8、分别接种小丁100cfu的白色念 珠菌， 枯草芽抱杆菌， 黑曲霉各2支， 另1支不接种作为空白对照， 培养5天， 逐 日观察结果.5.2.4结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管生长良好，判该培养基的灵 敏度检查符合规定.5.3薄膜过滤法5.3.1取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲冼，在最后一次的冲 洗液中加入小丁100cfu的试验菌，过滤；5.3.2取出滤膜接种至液体硫乙醇酸盐培养基或胰蛋白豚大豆肉汤培养基中，或将培养基加至滤筒内；5.3.3另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照；5.3.4置规定温度培养35天.各试验菌同法操作.5.4直接接种法5

9、.4.1取符合直接接种法培养基用量要求的液体硫乙醇酸盐培养基8管,分别接入小丁100cfu的金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，生抱梭菌，铜绿假单抱菌各2管；5.4.2取符合直接接种法培养基用量要求的胰蛋白豚大豆肉汤培养基6管，分别接入小丁100cfu的白色念珠菌，枯草芽抱杆菌，黑曲霉各2管；5.4.3其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培制定：XX碓亏忍:日期:2-Mar-19修言丁版次：2XXX有限公司文件编号XXXPage 4 of 5工作指引名称:抑真菌，抑细菌试验养35天.5.5结果判断5.5.1与对照管比较，如含供试品的各容器中的试验菌生长良好，则说明供试品的该检 验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和 检查条件进行供试品的无菌检查；5.5.2如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱，缓慢或不生长，则说明供试品的该 检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用 中和剂或灭活剂，更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法 验证试验.备注:方法验证试验可与供试品的无菌检查同时进行，或外发至具有微生物检验 资质的实验室进行.6文件保存期限相关检测报告保存10年.7附录:无制定：XX碓亏忍:日期:2-Mar-19修言丁版次：2XXX有限公司文件编