显微技术课程论文-拟南芥AtASK21基因突变对植株根发育的影响

1、研究生课程论文（作业）封面（ 2015 至 2016 学年度 第 2 学期）课 程 名 称： 植物显微技术 课 程 编 号： 学 生 姓 名： 学 号： 年 级： 任 课 教 师: 提 交 日 期： 2015 年 7 月 1 日成 绩：_教 师 签 字：_开课-结课：第 7 周-第 12 周评 阅 日 期： 年 月 日东北农业大学研究生院制拟南芥AtASK21基因突变对植株根发育的影响 东北农业大学 生命科学学院 黑龙江 哈尔滨 150030摘要：当前，突变体已成为功能生物学研究的重要工具。模式植物拟南芥突变体的研究能促进其在功能、进化上的了解。本研究发现拟南芥AtASK21基因突变导致植株发

2、育迟缓，根径变小，同时纵切根发现，突变体ask21细胞长度减小，数量增多。关键词：拟南芥；突变体；ASK21；发育引言石蜡切片组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。拟南芥突变体已成为功能生物学研究的重要工具。其在群体遗传变异、自发突变体表型、人工突变体库构建、突变体基因功能分析等方面取得的进展。拟南芥突变体的研究能促进其在功能、进化上的了解，更有助于其他高等植物的基因功能分析。泛素化过程在植物多种细胞反应中起着重要的作用，如细胞

3、分裂周期的调控，激素信号传导和胁迫响应等1。S期激酶相关蛋白1（SKP1）是一SCF复合体的组分之一，参与真核生物中的蛋白泛素化过程2。在拟南芥中已确定21个同源基因统称为拟南芥类SKP1基因（ASKs）3。ASK1是在拟南芥中第一个分离出的SKP1同源基因4，5，已报道有TIR1 F-box及COI1 等F-box蛋白与ASK1相互作用6，7。ASK2与ASK1相似性是最高的8，其同样也参与到调控减数分裂过程。在ask1突变体中，超表达ASK1可以弥补这种突变使花粉和四分体的正常比率提高，超表达ASK2也可以部分弥补这种突变所引起的败育，但明显不如前者。 当然，即使是超表达ASK1也无法使a

4、sk突变体恢复到野生型的水平。在ask1突变体中，减数分裂的很多过程会出现异常，比如染色体凝缩、同源染色体结合与分离异常，而这些异常最终导致联会与分离的紊乱。有研究表明ASK1蛋白能够通过定位减数分裂早期调控因子或需降解的基质蛋白来控制染色质的结构，从而影响减数分裂的正常进行9。有研究证实ASK1在减数第一次分裂前期对于同源染色体重组、染色质从核膜上释放以及核仁的移动与重构都起到十分重要的作用10。另外，在ask1突变体中，拟南芥位于第2轮和3轮的花瓣和雄蕊出现异常，即矮小而且具有花瓣与雄蕊共同特征的器官会在很多花中出现，出现与ufo突变体类似的表型。UFO是一个花分生组织特异性基因， 它可以

5、对LFY和AP1的花分生组织形态建成对ASK1引起雄性不育起到辅助作用， 同时参与生长素应答作用11。ASK2蛋白，具有ASK最相似的序列，能够替代ASK1参与雄性减数分裂。此外ask1/ask2双突变体表现出在胚胎期的发育迟缓，和在幼苗期的出现致死现象。除ASK1，ASK2以外，ASK家族的其他成员功能也有一定的研究。通过T -DNA插入ask11/ask12的突变体发现没有明显的表型变化。 通过Ds插入突变体ask14/ask18在发育上的表型同样不明显。此外，不同于典型的ASKs，ASK20和ASK21在结构上明显区别于其他的ASKs，他们在拟南芥ASK蛋白的系统结构聚类分析中聚集到另一

6、个分支。据报道，蛋白ASK20a和ASK20b在酵母双杂和三杂交系统中不能与CUL1相互作用，可能会起到阻止SCF复合物的其他组分结合形成SCF复合物的作用12。1材料方法1.1 植物材料 植物材料选择哥伦比亚野生型拟南芥与ask21突变体植株1. 2方法采用石蜡切片法制备标本进行观察，具体步骤如下：第一天安排准备工作：在操作之前配制30%、50%、70%、85%、95%的酒精溶液（利用95%的酒精溶液配制）、100%酒精。 操作时间操作步骤 13：00将材料至于70%的酒精中 15：00将材料至于85%的酒精中 17：00将材料至于95%的酒精中，其中加入几滴1%蕃红溶液中第二天的安排准备工

7、作：在操作之前配制2/3酒精+1/3二甲苯、1/2酒精+1/2二甲苯、1/3酒精+2/3二甲苯、纯二甲苯、石蜡（熔点52-54）、先预热温箱使其稳定在35-37。操作时间操作步骤7：00将材料至于100%的酒精中8：00将材料至于100%的酒精中9：00将材料至于2/3酒精+1/3二甲苯中11：00将材料至于1/2酒精+1/2二甲苯中13：00将材料至于1/3酒精+2/3二甲苯中15：00将材料至于100%二甲苯中16：00将材料至于100%二甲苯中17：00向小瓶中加入石蜡屑，使其达到饱和，放入35-37的温箱中过夜注：叠纸盒并在上面编号：在盒壁上写上欲包埋的材料名称第三天的安排准备工作：在

8、操作之前，将蜡入在敞口瓶中在浸蜡箱中熔化、准备好小盒、水盆及凉水。操作时间操作步骤8：00倒出1/2二甲苯石蜡后，再倒入1/2溶化的石蜡10：00倒出1/2二甲苯石蜡后，再倒入1/2溶化的石蜡12：00倒出1/2二甲苯石蜡后，再倒入1/2溶化的石蜡2：00倒出全部的石蜡后，倒入纯的石蜡3：00倒出全部的石蜡后，倒入纯的石蜡4：00包埋：浸蜡后，将事先叠好的小盒放在桌上，取事先溶好的石蜡倒入盒中，然后迅速从温箱中取出材料，移入盒内，并注意摆好位置和切面，等盒内石蜡表面开始凝固时，将纸盒移至冷水中冷却加速凝固。待完全凝固后，从水盆中取出试干，等等切片。 第四天的安排准备工作：调好旋转切片机，磨好切

9、片机的刀，刀片，干净的载片，梅氏粘贴剂，蒸馏水，酒精灯，解剖刀，毛笔等第一步：切片1 固着和修整：取包埋好的材料，将蜡块的材料之间切一适当深沟，用手掰开，用解剖刀切去材料周围的石蜡，仅留部分不使材料暴露的适当大小方块，并将切面相对的一面粘附在一个木块上。2 将上述的木块固定的旋转切片机的夹物部上，调节切片厚度（10-15微米）及切片刀的角度，旋转切片机手轮柄即可切成连续的蜡带。第二步：粘片取干净载片，用清洁手指蘸少许梅氏粘贴齐均匀地涂在载片上（一定要薄），再在其上加数滴蒸馏水，分割蜡带将蜡片浮于水上，在酒精灯上微微加热，使其展平，倾斜载片上，排去多余水分，用解剖刀（针），调整材料位置后，放35

10、-37度的温箱干燥。第五天的安排准备工作：染色缸、各级浓度的酒精、酒精与二甲苯的按比例混合溶液，平面皿，费液缸，中性胶（加拿大树胶），盖片，镊子，标签纸。第一步：染色1 先将干燥好的载片放入盛二甲苯的染色缸内去蜡10分钟，直到没有蜡为止。2 取出载片分别在材料上依次滴加二甲苯、1/2纯酒精+1/2二甲苯、纯酒精、蒸馏水。各级用2分钟，用蕃红染色液染2-3分钟，加入几滴蒸馏水去掉辅色，然后，加入30%酒精、50%酒精、70%酒精、85%酒精，各级为2-3分钟，加入固绿染色液染色10-30秒，95%酒精，（停留一会），100%酒精（加入两次），1/2纯酒精+1/2二甲苯，二甲苯。第二步：透明滴染后

11、的材料再放入另一盛二甲苯的染色缸中（10-30分钟）。第三步：封固取透明好的切片，将材料周围擦拭干净，滴一滴加拿大树胶后，再取干净的盖片从树胶滴一侧放下盖好，并防止气泡发生。第四步：用显微镜观察并选择典型的结构进行照相。2 结果与分析2. 1拟南芥AtASK21基因突变使植株根系根径减小通过观察发现，拟南芥ask21突变体植株的根径明显小于野生型（图1）。2.2 拟南芥AtASK21基因突变使植株根细胞增多，尺寸减小通过观察发现，拟南芥ask21突变体植株根中的细胞数量明显多于野生型，而细胞大小要小于野生型（图2）。3结论本研究发现拟南芥AtASK21基因突变导致植株发育迟缓，根径变小，同时纵

12、切根发现，突变体ask21细胞长度减小，数量增多。参考文献：1 D Zhu, H Cai, X Luo, et al., Over-expression of a novel JAZ family gene from Glycine soja, increases salt and alkali stress tolerance J. Biochem Biophys Res Commun, 2012. 426(2): 273-9.2 Y Ge, Y Li, Y M Zhu, et al., Global transcriptome profiling of wild soybean (Glyc

13、ine soja) roots under NaHCO3 treatment J. BMC Plant Biol, 2010. 10: 153.3 Y Ge, Y Li, D K Lv, et al., Alkaline-stress response in Glycine soja leaf identifies specific transcription factors and ABA-mediated signaling factors J. Funct Integr Genomics, 2011. 11(2): 369-79.4 X Bai, J Liu, L Tang, et al

14、., Overexpression of GsCBRLK from Glycine soja enhances tolerance to salt stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa) J. Functional Plant Biology, 2013. 40(10): 1048.5 L Tang, H Cai, W Ji, et al., Overexpression of GsZFP1 enhances salt and drought tolerance in transgenic alfalfa (Medicago sativa

15、L.) J. Plant Physiol Biochem, 2013. 71: 22-30.6 S Mahajan, G K Pandey, and N Tuteja, Calcium- and salt-stress signaling in plants: shedding light on SOS pathway J. Arch Biochem Biophys, 2008. 471(2): 146-58.7 X Yao, T Horie, S Xue, et al., Differential sodium and potassium transport selectivities of

16、 the rice OsHKT2;1 and OsHKT2;2 transporters in plant cells J. Plant Physiol, 2010. 152(1): 341-55.8 Z Ali, H C Park, A Ali, et al., TsHKT1;2, a HKT1 homolog from the extremophile Arabidopsis relative Thellungiella salsuginea, shows K(+) specificity in the presence of NaCl J. Plant Physiol, 2012. 15

17、8(3): 1463-74.9 R Munns and M Tester, Mechanisms of salinity tolerance J. Annu Rev Plant Biol, 2008. 59: 651-81.10 F J Quintero, J Martinez-Atienza, I Villalta, et al., Activation of the plasma membrane Na/H antiporter Salt-Overly-Sensitive 1 (SOS1) by phosphorylation of an auto-inhibitory C-terminal domain J. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(6): 2611-6.11 R Quan, H Lin, I Mendoza, et al., SCABP8/CBL10, a putative calcium sensor, interacts with the protein kinase SOS2 to protect Arabidopsis sh