维生素d与糖尿病的联系研究方案

1、2021/3/261一、立题依据及意义一、立题依据及意义 2021/3/262糖尿病 （diabetes mellitus） 定义定义:一种在遗传和环境因素长期共同作用下一种在遗传和环境因素长期共同作用下,由由于胰岛素分泌绝对或者相对不足所导致的渐进性于胰岛素分泌绝对或者相对不足所导致的渐进性蛋白质、脂肪、水和电介质代谢发生紊乱的一系蛋白质、脂肪、水和电介质代谢发生紊乱的一系列综合征列综合征,其中以高血糖为主要标志。其中以高血糖为主要标志。2021/3/263 糖尿病患病人数与日俱增我国每天新增糖尿病患者约3000例每年大约增加120万例糖尿病患者预计到2025年,中国的糖尿病患者将超过500

2、0万2021/3/264型糖尿病患病率特点 2型糖尿病患者约占糖尿病患者总数的90%,多发生于四十岁以上的人群和老年人,近年其发病年龄有下降趋势。 患病率急剧增加 血糖升高,但未达到糖尿病诊断标准者大量存在 各地发病状况差异巨大 农村城市化,糖尿病患病率增加2021/3/265型糖尿病发病年龄的年轻化 逐代年轻现象:子代发病年龄低于父母 近年来儿童2型糖尿病患病率迅速增加,值得关注2021/3/266维生素D与型糖尿病 型糖尿病风险人群总体血清维生素D水平低于非风险人群。 伴有轻微肾功能不全的型糖尿病患者,其心血管疾病的发病率与其维生素D水平呈负相关。 与那些维生素D浓度高于13.9 nmol

3、/L的患者相比,严重缺乏维生素D(少于13.9 nmol/L)的患者死亡的可能性要高103%,死于心血管疾病的可能性要高95%。 2021/3/267维生素D与型糖尿病的相关研究 非籍美国黑人患非籍美国黑人患NIDDM的比例较高的比例较高,同时他们的维生素同时他们的维生素D缺乏率也很高缺乏率也很高,而补充维生素而补充维生素D对他们的对他们的NIDDM也存在一也存在一定的治疗作用。定的治疗作用。 The potential to improve diabetes control with vitamin D replacement in African American patients: ca

4、se report and literature review 人们一直认为人们一直认为,维生素含量高可能会增加人们患型维生素含量高可能会增加人们患型糖尿病的风险糖尿病的风险,但我们的研究并没有发现这方面的证据。但我们的研究并没有发现这方面的证据。 克内克特博士所进行的追踪研究中克内克特博士所进行的追踪研究中,共有人患上共有人患上型糖尿病。统计数据显示型糖尿病。统计数据显示,当获取的血液样本排除了年当获取的血液样本排除了年龄、性别和季节因素后龄、性别和季节因素后,血液中维生素含量和罹患血液中维生素含量和罹患型糖尿病的关系与之前的看法截然相反型糖尿病的关系与之前的看法截然相反 。 芬兰赫尔辛基国

5、家公共卫生研究所的保罗芬兰赫尔辛基国家公共卫生研究所的保罗克内克特博士克内克特博士 2021/3/268维生素D预防型糖尿病的机制 维生素D在代谢综合征中有重要作用,具有改善胰岛素敏感性作用的潜力。 维生素D可以令人体免疫系统保持健康,保护人体细胞免遭损坏,如产生胰岛素的胰腺细胞。 肥胖人群中2型糖尿病发生率增加,也和维生素D有关:一方面,维生素D易于在人体脂肪沉积,但不再具有生物活性;另一方面,维生素D可以调节脂肪细胞储脂作用。2021/3/269 创新之处及目的创新之处及目的 目前目前,关于关于2型糖尿病的研究有很多型糖尿病的研究有很多,但大多数都是研究但大多数都是研究如何治疗的。如果可以

6、通过一些简单的方法来预防它在人如何治疗的。如果可以通过一些简单的方法来预防它在人群中的发生群中的发生,效果将更好。从以上的介绍中可以看出维生效果将更好。从以上的介绍中可以看出维生素素D与与2型糖尿病的发生似乎存在一些关系型糖尿病的发生似乎存在一些关系,所以所以,针对这一针对这一问题问题,我们小组设计了这项实验我们小组设计了这项实验,来探索维生素来探索维生素D对对NIDDM的发生究竟有什么作用。的发生究竟有什么作用。 我们推断不同浓度的维生素我们推断不同浓度的维生素D对机体的作用不同对机体的作用不同,大剂大剂量维生素量维生素D或维生素或维生素D缺乏都可能会促进缺乏都可能会促进NIDDM的发生的发

7、生,而而少量的维生素少量的维生素D会减少会减少NIDDM的发生。如果结论得到证实的发生。如果结论得到证实,那么那么,对易于发生维生素对易于发生维生素D缺乏或过多的人群相应的补充或缺乏或过多的人群相应的补充或降低维生素降低维生素D的摄入的摄入,将对这类人群将对这类人群NIDDM的发生起到一的发生起到一定的预防作用。定的预防作用。2021/3/2610二、技术路线二、技术路线 2021/3/2611动物动物:120只健康雄性小鼠只健康雄性小鼠 药品药品:STZ（链佐脲菌素（链佐脲菌素,Streptozotocin ）、）、1,25-(OH)2D3、柠檬酸盐缓冲液、花生油、柠檬酸盐缓冲液、花生油、肝

8、素肝素仪器设备仪器设备:哺乳动物手术器械一套、注射器、哺乳动物手术器械一套、注射器、试管、便携式血糖仪、试管、便携式血糖仪、SDS-PAGE电泳仪和电泳仪和转膜仪、摇床、离心机、胰岛素转膜仪、摇床、离心机、胰岛素ELISA 检测检测试剂盒、光学显微镜试剂盒、光学显微镜2021/3/2612实验步骤实验步骤 1、模型的建立、模型的建立:取只体重在取只体重在2025g的健康的健康雄性小鼠雄性小鼠,连续连续7d腹腔注射腹腔注射STZ（20 mgkg-1）,期间喂食高热量食物。分别于期间喂食高热量食物。分别于注射注射STZ的第的第1、2、3、4、6周末各测一次周末各测一次血糖血糖,以血糖水平持续高于以

9、血糖水平持续高于11.1mmol/L为判为判断成模的标准。造模期间死亡动物不计入断成模的标准。造模期间死亡动物不计入统计范围。统计范围。2021/3/26132、动物分组、动物分组:每组每组30只小鼠（实验在相对较暗的环境中进行）只小鼠（实验在相对较暗的环境中进行） 糖尿病组糖尿病组,隔日腹腔注射花生油隔日腹腔注射花生油(5gkg-1),共共14次次;连续连续7d腹腔注腹腔注射射STZ（20 mgkg-1）;分别于注射分别于注射STZ的第的第1、2、3、4、6周末周末各测一次血糖各测一次血糖,以血糖水平持续高于以血糖水平持续高于11.1mmol/L为判断成模的标为判断成模的标准准,期间喂食高热

10、量食物。造模期间死亡动物不计入统计范围。期间喂食高热量食物。造模期间死亡动物不计入统计范围。 少量少量Vd组组,隔日腹腔注射隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（2gkg-1）,共共14次次; 连连续续7d腹腔注射腹腔注射STZ（20 mgkg-1）,期间喂食高热量食物。期间喂食高热量食物。 大量大量Vd组组,隔日腹腔注射隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（5gkg-1）,共共14次次; 连连续续7d腹腔注射腹腔注射STZ（20 mgkg-1）,期间喂食高热量食物。期间喂食高热量食物。 空白对照组空白对照组,隔日腹腔注射花生油隔日腹腔注射花生油(5gkg-1),共共14次次;连续连续7d腹腔

11、腹腔注射与糖尿病组等容量柠檬酸盐缓冲液注射与糖尿病组等容量柠檬酸盐缓冲液,期间喂以正常食物。期间喂以正常食物。2021/3/2614 3、样本采集与处理、样本采集与处理:实验第实验第9周周,开始记录一开始记录一周内各组小鼠的尿量和饮水量。第周内各组小鼠的尿量和饮水量。第9周结束周结束后后,各组小鼠空腹各组小鼠空腹8小时后小时后,测糖耐量。之后测糖耐量。之后,断尾取血用便携式血糖仪检测血糖水平断尾取血用便携式血糖仪检测血糖水平;采采集血清用胰岛素集血清用胰岛素ELISA 检测试剂盒检测血检测试剂盒检测血清胰岛素水平清胰岛素水平;采集肝脏标本利用细胞免疫采集肝脏标本利用细胞免疫组化及组化及West

12、ern blot法检测胰岛素受体的法检测胰岛素受体的表达情况表达情况;采集胰腺标本利用采集胰腺标本利用Western blot法检测胰岛细胞法检测胰岛细胞Bax和和Bcl-xL蛋白表达水平蛋白表达水平;取胰腺制作标本取胰腺制作标本,观察胰岛观察胰岛B细胞损伤情况。细胞损伤情况。2021/3/2615 4、统计学分析、统计学分析:SPSS10.0软件处理。结果软件处理。结果以以s表示。同组内处理前后比较用配对表示。同组内处理前后比较用配对t检验。组间比较用完全随机设计的方差分检验。组间比较用完全随机设计的方差分析析,若结果有意义再进行多个样本均数间比若结果有意义再进行多个样本均数间比较的较的SN

13、K-q检验（检验（Bax、Bcl-xL阳性率经阳性率经平方根转化后再进行统计分析）。糖尿病平方根转化后再进行统计分析）。糖尿病发病率用发病率用fisher确切概率法。确切概率法。P0.05表示表示差异有显著性差异有显著性,P0.01表示差异有极显著表示差异有极显著性。性。2021/3/2616三、结果预测2021/3/2617实验时程时间时间（周）（周）糖尿病组糖尿病组少量补充少量补充Vd组组大量补充大量补充Vd组组对照对照14隔日腹腔注射花生隔日腹腔注射花生油（油（5gkg-1）,共共14次次隔日腹腔注射隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（2gkg-1）,共共14次次;隔日腹腔注射隔日腹腔

14、注射1,25-(OH)2D3（5gkg-1）,共共14次次;隔日腹腔注射花生油隔日腹腔注射花生油（5gkg-1）,共共14次次4连续连续7d腹腔注射腹腔注射STZ（20 mgkg-1）（与上面操作间隔（与上面操作间隔6小时）小时）连续连续7d腹腔注射腹腔注射STZ（20 mgkg-1）（与上面操作间（与上面操作间隔隔6小时）小时）连续连续7d腹腔注射腹腔注射STZ（20 mgkg-1）（与上面操作间（与上面操作间隔隔6小时）小时）连续连续7d腹腔注射与糖尿病组等腹腔注射与糖尿病组等容量柠檬酸盐缓冲液（与上面容量柠檬酸盐缓冲液（与上面操作间隔操作间隔6小时）小时）49喂食高热量食物喂食高热量食物

15、,每周末测血糖每周末测血糖喂食高热量食物喂食高热量食物喂食高热量食物喂食高热量食物喂食喂食正常食物正常食物9每天测尿量和饮水每天测尿量和饮水量量每天测尿量和饮水每天测尿量和饮水量量每天测尿量和饮水每天测尿量和饮水量量每天测尿量和饮水量每天测尿量和饮水量2021/3/2618 9周后周后,各组小鼠空腹各组小鼠空腹8小时后小时后,测糖耐量。之后测糖耐量。之后,断断尾取血用便携式血糖仪检测血糖水平尾取血用便携式血糖仪检测血糖水平;采集血清用采集血清用胰岛素胰岛素ELISA 检测试剂盒检测血清胰岛素水平检测试剂盒检测血清胰岛素水平;采采集肝脏标本利用细胞免疫组化及集肝脏标本利用细胞免疫组化及Weste

16、rn blot法法检测胰岛素受体（检测胰岛素受体（IR）的表达情况）的表达情况;采集胰腺标本采集胰腺标本利用利用Western blot法检测胰岛细胞法检测胰岛细胞Bax和和Bcl-xL蛋白表达水平蛋白表达水平;取胰腺制作标本取胰腺制作标本,观察胰岛观察胰岛B细胞损细胞损伤情况。伤情况。 记录实验结果记录实验结果,并分析并分析.2021/3/2619 组别组别平均水平平均水平糖尿病组糖尿病组少量补充少量补充Vd组组大量补充大量补充Vd组组对照对照饮水量饮水量(ML)尿量尿量(ML)糖耐量糖耐量血糖血糖(mmol/L)胰岛素含量胰岛素含量IRBcl-xlBax胰岛胰岛B细胞损细胞损伤情况伤情况数

17、据表格数据表格2021/3/2620 数据处理结果存在具有统计学意义数据处理结果存在具有统计学意义,则结果说明则结果说明Vd确实对确实对2型糖尿病的发生有所影响。型糖尿病的发生有所影响。 饮水量与尿量饮水量与尿量:少量组少量组糖尿病组糖尿病组糖尿病组糖尿病组大量组大量组 血糖血糖:少量组少量组糖尿病组糖尿病组糖尿病组糖尿病组大量组大量组 Bcl-xl表达水平表达水平:少量组少量组糖尿病组糖尿病组大量组大量组 Bax表达水平表达水平:少量组少量组糖尿病组糖尿病组大量组大量组 胰岛胰岛B细胞损伤情况细胞损伤情况:少量组少量组糖尿病组糖尿病组大量组大量组理想结果理想结果2021/3/2621四、讨论

18、2021/3/2622 糖尿病糖尿病是一种代谢紊乱综是一种代谢紊乱综合症。它是由于胰岛素分泌相合症。它是由于胰岛素分泌相对或绝对不足、胰岛素活性的对或绝对不足、胰岛素活性的缺乏或是胰岛素抵抗等原因而缺乏或是胰岛素抵抗等原因而导致的以高血糖为特征的疾病导致的以高血糖为特征的疾病。 2021/3/2623WHO推荐糖尿病分为四种类型推荐糖尿病分为四种类型 1型糖尿病又称胰岛素型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病（依赖型糖尿病（IDDM） 患者病状通常出现在患者病状通常出现在儿童或青少年时期。儿童或青少年时期。是由各种原因引起的是由各种原因引起的自身免疫机制紊乱所自身免疫机制紊乱所致的胰岛致的胰岛B细胞破

19、坏细胞破坏,是胰岛素分泌绝对缺是胰岛素分泌绝对缺乏乏,血糖升高血糖升高 。 2型糖尿病又称非胰岛型糖尿病又称非胰岛素依赖性糖尿病素依赖性糖尿病（NIDDM） 目前认为目前认为,是环境因素是环境因素和遗传因素共同作用和遗传因素共同作用的结果的结果,病因与胰岛素病因与胰岛素抵抗和胰岛素分泌不抵抗和胰岛素分泌不足有关足有关 。还可能与向还可能与向心性肥胖以及衰老所心性肥胖以及衰老所致的体内自由基生成致的体内自由基生成增多密切相关。增多密切相关。2021/3/2624关于关于NIDDM 由于胰岛由于胰岛B细胞响应有缺陷细胞响应有缺陷,导致胰岛素分泌不足导致胰岛素分泌不足: 产生的数量产生的数量 分泌时

20、间分泌时间 末梢组织对胰岛素的响应性和敏感性都明显减弱末梢组织对胰岛素的响应性和敏感性都明显减弱 肝脏对胰岛素的敏感性减弱肝脏对胰岛素的敏感性减弱 对于正常人来说对于正常人来说, ,胰岛素可以抑制肝脏释放葡萄糖入血。胰岛素可以抑制肝脏释放葡萄糖入血。而对于而对于NIDDMNIDDM病人病人, ,肝脏持续分解糖原形成葡萄糖进入血液肝脏持续分解糖原形成葡萄糖进入血液。2021/3/2625胰岛素抵抗胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)是指是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降性下降,即正常剂量的胰岛素产生低于正即正常剂量的胰岛素产生低

21、于正常生物学效应的一种状态常生物学效应的一种状态 2型糖尿病中一部分病人以胰岛素抵抗为型糖尿病中一部分病人以胰岛素抵抗为主主,病人多肥胖病人多肥胖,因胰岛素抵抗因胰岛素抵抗,胰岛素敏感胰岛素敏感性下降性下降,初期可能出现血中胰岛素增高以初期可能出现血中胰岛素增高以补偿其胰岛素抵抗补偿其胰岛素抵抗,随着病情的发展随着病情的发展,出现出现胰岛素抵抗伴胰岛素分泌的绝对不足。胰岛素抵抗伴胰岛素分泌的绝对不足。 2021/3/2626维生素维生素D 维生素维生素D是类固醇衍生物是类固醇衍生物,属脂溶性维生素属脂溶性维生素类类,其中最主要的是维生素其中最主要的是维生素D3。人体内的胆。人体内的胆固醇在皮肤

22、细胞被氧化成维生素固醇在皮肤细胞被氧化成维生素D3原原,经紫经紫外线照射转变为维生素外线照射转变为维生素D3。 维生素维生素D可以调节可以调节钙、磷钙、磷的代谢的代谢 在一定人群中经常可出现维生素在一定人群中经常可出现维生素D的缺乏的缺乏,（黑人（黑人,不晒太阳不晒太阳,饮食不均衡饮食不均衡,长期使用抗癫长期使用抗癫痫药物（苯巴比妥）痫药物（苯巴比妥）相反也有人过量相反也有人过量补充维生素补充维生素D造成体内维生素造成体内维生素D含量过含量过高高 。2021/3/2627维生素D与NIDDM的关系 研究发现维生素研究发现维生素D与与2型糖尿病的发生关系型糖尿病的发生关系密切密切.低维生素低维生

23、素D血症的人群中血症的人群中2型糖尿病的型糖尿病的发病率明显增高发病率明显增高,而补充维生素而补充维生素D对这些病对这些病人也有一定的治疗作用。人也有一定的治疗作用。 其机制可能是低维生素其机制可能是低维生素D抑制胰岛素的合成抑制胰岛素的合成和分泌和分泌,加重胰岛素抵抗而导致糖尿病的发加重胰岛素抵抗而导致糖尿病的发生发展生发展 2021/3/2628关于实验模型 实验中应用的实验中应用的STZ是是链脲佐菌素链脲佐菌素（Streptozotocin）,这这种化学物质对胰岛种化学物质对胰岛细胞有选择性破坏作用细胞有选择性破坏作用 。 大剂量注射时大剂量注射时,由于直接引起胰岛由于直接引起胰岛细胞的

24、广泛破细胞的广泛破坏坏,可造成可造成1型糖尿病模型型糖尿病模型;而注射较少量而注射较少量STZ时时,由由于只是破坏一部分胰岛于只是破坏一部分胰岛细胞的功能细胞的功能,造成外周组造成外周组织对胰岛不敏感织对胰岛不敏感,同时给予高热量饲料喂养同时给予高热量饲料喂养,两者两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型型糖尿病的动物模型。糖尿病的动物模型。 本次试验中本次试验中,相对于补充相对于补充Vd的两组的两组,糖尿病组处于糖尿病组处于维生素维生素D缺乏的状态缺乏的状态 。2021/3/2629关于实验数据 尿量和饮水量尿量和饮水量: 糖尿病患者在早期通常会出

25、现有所谓的糖尿病患者在早期通常会出现有所谓的“三多一少三多一少”症症状状:多饮、多食、多尿和消瘦。糖尿病病人血糖升高多饮、多食、多尿和消瘦。糖尿病病人血糖升高,而高而高血糖对人体损害很大血糖对人体损害很大,人体为了保护自己人体为了保护自己,不得不通过尿液不得不通过尿液排出多余糖分排出多余糖分,致使尿量明显增多。人如果尿得太多致使尿量明显增多。人如果尿得太多,体内体内损失了大量的水分损失了大量的水分,就会感到口渴难忍。所以尿量和饮水就会感到口渴难忍。所以尿量和饮水量明显增高量明显增高,可以一定程度上反映是否患糖尿病。若实验可以一定程度上反映是否患糖尿病。若实验中尿量和饮水量一项出现中尿量和饮水量

26、一项出现“少量组少量组糖尿病组糖尿病组大量组大量组”现现象象,则可说明大剂量维生素则可说明大剂量维生素D或维生素或维生素D缺乏都会促进缺乏都会促进NIDDM的发生的发生,而少量的维生素而少量的维生素D会减少会减少NIDDM的发生的发生2021/3/2630 血糖血糖: 血糖浓度是反映是否患糖尿及病情轻血糖浓度是反映是否患糖尿及病情轻重的最重要的指标重的最重要的指标,为主要的观察项目。它为主要的观察项目。它可以直接反应糖尿病的发病率可以直接反应糖尿病的发病率,比较出不同比较出不同浓度的浓度的Vd对对NIDDM的发生的影响。的发生的影响。 2021/3/2631糖耐量糖耐量: 通俗地说就是人体对葡

27、萄糖的耐受能通俗地说就是人体对葡萄糖的耐受能力。医院通常会对疑似糖尿病患者进行糖耐力。医院通常会对疑似糖尿病患者进行糖耐量测试量测试,如果糖耐量试验服糖后如果糖耐量试验服糖后2小时血糖介小时血糖介于于7.8至至 11.1毫摩毫摩/升升,表明机体糖耐量能力减表明机体糖耐量能力减低低,也就是说身体对糖的吸收和利用比正常也就是说身体对糖的吸收和利用比正常状态差了。糖耐量越低说明机体对糖的耐受状态差了。糖耐量越低说明机体对糖的耐受越差越差,病情越严重。所以可以通过检测实验病情越严重。所以可以通过检测实验动物的糖耐量来反映小鼠是否患糖尿病动物的糖耐量来反映小鼠是否患糖尿病,及及病情轻重程度。病情轻重程度

28、。2021/3/2632胰岛素含量胰岛素含量: 该项指标可一定程度反映不同浓度维生素该项指标可一定程度反映不同浓度维生素D对胰岛素分泌功能的影响。但对胰岛素分泌功能的影响。但NIDDM初期可初期可能出现血中胰岛素增高以补偿其胰岛素抵抗能出现血中胰岛素增高以补偿其胰岛素抵抗,随着病情的发展随着病情的发展,出现胰岛素抵抗伴胰岛素分出现胰岛素抵抗伴胰岛素分泌的绝对不足。所以本次试验中该项指标需与泌的绝对不足。所以本次试验中该项指标需与其他指标结合比较才能发挥作用。其他指标结合比较才能发挥作用。2021/3/2633肝脏胰岛素受体（肝脏胰岛素受体（insulin receptor）的表达水平）的表达水平: 肝脏对胰岛素的敏感性是保证机体血糖正常的重要肝脏对胰岛素的敏感性是保证机体血糖正常的重要因素。一些研究发现一定浓度的维生素因素。一些研究发现一定浓度的维生素D可能刺激胰岛可能刺激胰岛素受体的表达从而增强胰岛素对葡萄糖转运的反应素