酶工程酶的别构效应学习教案

1、会计学1酶工程酶的别构效应酶工程酶的别构效应第一页，编辑于星期二：十点 十二分。 本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以外的部位，通过外的部位，通过酶分子构象的改变来调节酶的活性酶分子构象的改变来调节酶的活性。这种效应叫做。这种效应叫做别构效应别构效应（allosteric effects），），这种效应剂叫做这种效应剂叫做别构效应剂别构效应剂，受别构效应剂影响的，受别构效应剂影响的酶叫酶叫

2、别构酶别构酶（allosteric enzyme）。）。 第1页/共72页第二页，编辑于星期二：十点 十二分。 生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应调节酶活性是各种酶情况适时地改变。利用别构效应调节酶活性是各种酶活性调节方式中活性调节方式中最迅速的一种最迅速的一种，大多数代谢物的反，大多数代谢物的反馈抑制就属于别构调节，也有一些代谢物可对代谢途馈抑制就属于别构调节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别构激活作用。径中的酶起别构激

3、活作用。 第2页/共72页第三页，编辑于星期二：十点 十二分。反馈抑制可分为五种类型：反馈抑制可分为五种类型： 线性通路中的反馈抑制线性通路中的反馈抑制一条途径的最终产物抑制途径中起始酶的活性一条途径的最终产物抑制途径中起始酶的活性。E1第3页/共72页第四页，编辑于星期二：十点 十二分。 趋同通路中的反馈抑制趋同通路中的反馈抑制 为了有效地合成为了有效地合成D，要求，要求B和和C的浓度大致相的浓度大致相等。当等。当C浓度大时，对产生浓度大时，对产生B的途径的最初的酶的途径的最初的酶有激活作用；当有激活作用；当B浓度大时，对产生浓度大时，对产生B的途径的最初的途径的最初的酶有抑制作用。的酶有抑

4、制作用。 第4页/共72页第五页，编辑于星期二：十点 十二分。 趋散通路中的反馈抑制趋散通路中的反馈抑制 EC和和ED为两种同工酶，分别受为两种同工酶，分别受C和和D的反馈抑制的反馈抑制。当。当C太多时，不仅抑制从太多时，不仅抑制从B到到C的第一个酶，而且抑的第一个酶，而且抑制从制从A到到B的第一个反应两种同工酶中的一种，使的第一个反应两种同工酶中的一种，使得得B合成的速率下降。合成的速率下降。B的合成不能完全停止，因为合的合成不能完全停止，因为合成成D还需要还需要B。当。当D太多时情况相似。太多时情况相似。 第5页/共72页第六页，编辑于星期二：十点 十二分。 顺序反馈抑制顺序反馈抑制 一条

5、途径中有多个反馈抑制步骤。一条途径中有多个反馈抑制步骤。 协调反馈抑制协调反馈抑制 需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制作用。作用。 第6页/共72页第七页，编辑于星期二：十点 十二分。 当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，ATP大量合成，大量合成，AMP和和ADP减少，由于减少，由于AMP和和ADP是异柠檬酸脱氢酶的激是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活乙酰活乙酰CoA

6、羧化酶和己糖激酶，同时抑制羧化酶和己糖激酶，同时抑制PFK（磷酸（磷酸果糖激酶）。激活乙酰果糖激酶）。激活乙酰CoA羧化酶可增强脂肪酸的羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶且抑制合成，激活己糖激酶且抑制PFK，可使，可使G-6-P更多更多地进入磷酸戊糖途径，合成更多的地进入磷酸戊糖途径，合成更多的NADPH，供脂肪，供脂肪酸合成使用。酸合成使用。 第7页/共72页第八页，编辑于星期二：十点 十二分。1一个典型的别构酶一个典型的别构酶天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶 天冬氨酸转氨甲酰酶（天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate trans-carbamoylase, ATC）是嘧啶核苷酸生物

7、合成途径的）是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一个酶（第一个酶（ UTP CTP）。）。第8页/共72页第九页，编辑于星期二：十点 十二分。 ATC的活性受到的活性受到CTP的强烈抑制，又受到的强烈抑制，又受到ATP的的高效激活。高效激活。第9页/共72页第十页，编辑于星期二：十点 十二分。 在对照、加在对照、加ATP、加、加CTP三种情况的三种情况的V对对S图中可以看出，对照呈图中可以看出，对照呈S形曲线而不是双曲线；加形曲线而不是双曲线；加ATP减小了反应的表观减小了反应的表观Km值，使曲线向双曲线靠值，使曲线向双曲线靠近；加近；加CTP增大了反应的表观增大了反应的表观Km值，使曲线的值，使曲线

8、的S形更加明显。加形更加明显。加ATP和和CTP并不影响并不影响Vm。 第10页/共72页第十一页，编辑于星期二：十点 十二分。第11页/共72页第十二页，编辑于星期二：十点 十二分。 为了解释这种现象，研究者设想在酶分子中有两为了解释这种现象，研究者设想在酶分子中有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另一个部位是一个部位是ATP或或CTP等效应剂的结合位点。利用选择等效应剂的结合位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，性修饰法修饰后一个部位后，ATC的活性并不丧失，但对的活性并不丧失，但对CTP抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选

9、抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道，ATC由由12条多肽链组成，条多肽链组成，2个个3亚基，亚基，3个个2亚亚基。基。 第12页/共72页第十三页，编辑于星期二：十点 十二分。rrcc第13页/共72页第十四页，编辑于星期二：十点 十二分。 根据对根据对ATC的研究，得出了的研究，得出了5点结论：点结论： 酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位。

10、位。 这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。 调节部位可与多种效应剂结合，并产生不同的效应。调节部位可与多种效应剂结合，并产生不同的效应。 效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶与底物的结合效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶与底物的结合能力和催化能力。能力和催化能力。 调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而后两者又是代谢调节的有效方式之一。后两者又是代谢调节的有效方式之一。 第14页/共72页第十五页，编辑于星期二：十点 十二分。 协同效应（协同效应（cooperative effect

11、s）也是多亚基）也是多亚基别构酶的一个特征。能与酶结合的底物、激活别构酶的一个特征。能与酶结合的底物、激活剂和抑制剂统称配体，所谓协同效应是指当一剂和抑制剂统称配体，所谓协同效应是指当一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个配体与酶结合。配体与酶结合。 第15页/共72页第十六页，编辑于星期二：十点 十二分。 同种效应和异种效应同种效应和异种效应 同种同种效应（效应（homotropic effects）指的是一）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的结合；异种效应（结合；异种效应（hetero

12、tropic effects）指的是）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与酶酶的结合。的结合。 第16页/共72页第十七页，编辑于星期二：十点 十二分。 正协同和负协同正协同和负协同 一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶结合叫正协同（结合叫正协同（positive cooperation），抑制另一），抑制另一分 子 配 体 与 酶 结 合 叫 负 协 同 （分 子 配 体 与 酶 结 合 叫 负 协 同 （n e g a t i v e cooperation）。）。 同种效应一般是正协同；异种

13、效应有正协同，同种效应一般是正协同；异种效应有正协同，也有负协同。也有负协同。 第17页/共72页第十八页，编辑于星期二：十点 十二分。 通过动力学作图，可以鉴别底物之间的正协同通过动力学作图，可以鉴别底物之间的正协同、负协同和无协同。、负协同和无协同。 第18页/共72页第十九页，编辑于星期二：十点 十二分。第19页/共72页第二十页，编辑于星期二：十点 十二分。 协同指数协同指数（cooperative index，CI）是指酶）是指酶的底物结合位点被底物饱和的底物结合位点被底物饱和90%和饱和和饱和10%（即（即V = 0.9Vm和和V = 0.1Vm）时的底物浓度之比，故协同）时的底物

14、浓度之比，故协同指数又称指数又称饱和比值饱和比值（Ratio saturation，Rs）。）。第20页/共72页第二十一页，编辑于星期二：十点 十二分。 对于一个可结合对于一个可结合n个底物分子的酶，其反应式可用个底物分子的酶，其反应式可用下式表示：下式表示：按米氏方程的推导过程可得按米氏方程的推导过程可得式中式中 这里假设这里假设n n个底物是同时结合上去和同时解离下个底物是同时结合上去和同时解离下来的。来的。 nSnmSKSVVnnSESSEKreturn第21页/共72页第二十二页，编辑于星期二：十点 十二分。当当V = 0.9Vm 时，时，S0.9 = ；当当V = 0.1Vm 时，

15、时，S0.1 = 。 nSK1)9(nSK1)91(1 . 09 . 0SSn181CI = Rs = =第22页/共72页第二十三页，编辑于星期二：十点 十二分。 因此，当因此，当n1时，时，CI81，和以前讲过的单底，和以前讲过的单底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当n 1时，时，CI 81，为正协同，表示，为正协同，表示V对对S改变的灵敏改变的灵敏度增加，且度增加，且n越大正协同效应越大；当越大正协同效应越大；当n 81，为负协同，表示，为负协同，表示V对对S改变的灵敏度减小，改变的灵敏度减小，且且n越小负协同效应越大。越小负协同效应越大

16、。n值即为协同系数值即为协同系数。 1 . 09 . 0SSn181CI = Rs = =第23页/共72页第二十四页，编辑于星期二：十点 十二分。 从理论上推导上式时，从理论上推导上式时，n是与酶结合的底物是与酶结合的底物分子数，但实际上测出的分子数，但实际上测出的n值（测定方法见后）有值（测定方法见后）有小于小于1的情况。上面说的的情况。上面说的n 1、n1、n S0.9或或 S S0.1），），n常等于常等于1，故在一个广泛的，故在一个广泛的S范围内范围内作图时，得到的是折线。作图时，得到的是折线。 第38页/共72页第三十九页，编辑于星期二：十点 十二分。 Hill模式忽略了模式忽略了

17、ES，ES2，ESn-1等形式的存等形式的存在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响，根据，根据Hill作图计算出来的作图计算出来的n值往往小于酶对底物值往往小于酶对底物的结合位点数，的结合位点数，Hb（hemoglobin，血红蛋白）上，血红蛋白）上有有4个个O2结合位点，但计算的结果是结合位点，但计算的结果是n2.62.8。在。在负协同效应中，每分子酶也结合负协同效应中，每分子酶也结合n个底物，但计算的个底物，但计算的结果却是结果却是n K2 K3 K4是正协同性，是正协同性，K1 K2 K3K2K3K4（内在解离常数）为正协同效应，（内

18、在解离常数）为正协同效应，K1K2K3K4为负协同效应。为负协同效应。 第60页/共72页第六十一页，编辑于星期二：十点 十二分。1酶的记忆现象酶的记忆现象 有些单体酶能有些单体酶能表现出表现出S形曲线，这也是因为形曲线，这也是因为别构效应引起的。别构效应引起的。1967年年Rabin提出酶提出酶底物复底物复合物能进行异构作用的机制来解释合物能进行异构作用的机制来解释S形形曲线。曲线。 ES必须先缓慢地异构成必须先缓慢地异构成FS，然后快速地分解（，然后快速地分解（break down）成）成F和和P，F能够回复到能够回复到E，也可以直，也可以直接与接与S结合形成结合形成FS。 return第

19、61页/共72页第六十二页，编辑于星期二：十点 十二分。 在低浓度在低浓度S时，酶主要以时，酶主要以E和和ES形式存在，产形式存在，产物形成速度被缓慢的物形成速度被缓慢的 异构化作用所限制。由异构化作用所限制。由于于S低，低，F有较多的比例回复到了有较多的比例回复到了E，只有少量的，只有少量的F直接与直接与S结合成结合成FS。当。当S高时，有较多的高时，有较多的F直接与直接与S结合成结合成FS，由于直接生成，由于直接生成FS，避免了，避免了 这个这个限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现出出S形曲线。形曲线。 反应式反应式第62页/共72页

20、第六十三页，编辑于星期二：十点 十二分。 别构激活剂与别构激活剂与E结合后可以提高异构化速率，结合后可以提高异构化速率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影响响k4及及k1也会影响也会影响S形曲线的形状。形曲线的形状。 第63页/共72页第六十四页，编辑于星期二：十点 十二分。 FS释放出释放出产物产物后仍保持后仍保持F构象可以认为是一构象可以认为是一种种“记忆记忆”现象。有记忆现象的酶称为记忆酶现象。有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双产。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中

21、的物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中的己糖激酶都是典型的记忆酶。己糖激酶都是典型的记忆酶。 第64页/共72页第六十五页，编辑于星期二：十点 十二分。 酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。 底物和激活剂形成底物和激活剂形成复合物，如复合物，如ATP-Mg2+，当，当ATP与与Mg2+ 以以1:1混合后以不同的量加到反应体系中，则加的混合后以不同的量加到反应体系中，则加的量增加量增加1倍，倍，ATP-Mg2+ 增加不止增加不止1倍。倍。 酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的底酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的底物不能作酶的底物。在低物不能作酶的底物。

22、在低S时，有较大比例的时，有较大比例的S与杂与杂质结合，而在较高质结合，而在较高S时，与杂质结合的时，与杂质结合的S比例下降，比例下降，所以表现出正协同假象。所以表现出正协同假象。 第65页/共72页第六十六页，编辑于星期二：十点 十二分。 随机机制的双底物反应随机机制的双底物反应 如果如果EEAEAB途径快于途径快于EEBEAB途径，途径，则当则当A或或B有一种饱和时，有一种饱和时，V对另一种底物浓度的关系约对另一种底物浓度的关系约为双曲线。但如果是为双曲线。但如果是B低于饱和浓度（低于饱和浓度（A不行），则不行），则V对对A的关系为的关系为S形曲线，形曲线， 因 为因 为在在 A 很 低

23、时 ，很 低 时 ，E主 要 与 高 浓 度 的主 要 与 高 浓 度 的B结 合 ， 使 反 应 主 要 走结 合 ， 使 反 应 主 要 走EEBEAB这条慢途径，整个反应速度较慢；随着这条慢途径，整个反应速度较慢；随着A的增加，快途径的增加，快途径占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出S形形曲线。曲线。 第66页/共72页第六十七页，编辑于星期二：十点 十二分。 酶对底物有极高的亲和力酶对底物有极高的亲和力 如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学参数，往往要使用较低的底物浓度，参数，往往要

24、使用较低的底物浓度，即即S不特大于不特大于E（因为底物浓度不太高时，酶就处于（因为底物浓度不太高时，酶就处于被底物饱和的被底物饱和的状态，为零级反应，没有变化，所以无法测定动力学参数状态，为零级反应，没有变化，所以无法测定动力学参数）。在这种条件下）。在这种条件下 不能约等于不能约等于 。 ) () (0ESESSESEKSESS S第67页/共72页第六十八页，编辑于星期二：十点 十二分。 酶对底物有极高的亲和力酶对底物有极高的亲和力其双倒数方程为：其双倒数方程为：1 41) (11) (112102002SESKESKESkVmm 双倒数作图会表现出假的正协双倒数作图会表现出假的正协同现象。如果酶反应速