《草地贪夜蛾抗药性监测技术规范》

1、ICS65-020-01B15DB34安徽省地方标准DB 34/ XXXXX2020草地贪夜蛾抗药性监测技术规范Guideline for insecticide resistance monitoring of the fall armyworm2020 - XX - XX发布2020 - XX - XX实施安徽省市场监督管理局发布DB/ XXXXXXXXX前言本标准按照 GB/T1.1-2020 标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准归口单位：安徽省农业标准化技术委员会。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省植物保护总站、安徽省农业科学院。本

2、标主要准起草人： 操海群、李桂亭、盛成旺、李秀霞、廖敏、蒋兴川、黄勇、董永成、袁松、宁伟文、黄超、郑兆阳、徐丽娜、陈浩梁草地贪夜蛾抗药性监测技术规范1 范围本标准规定了有关草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda (J.E.Smith)抗药性监测的术语、定义、仪器、用具、药品及抗性测定方法。本标准适用于安徽省草地贪夜蛾发生区的抗药性监测。2 规范性引用文件下列文件对于本标准的应用必不可少。凡是标注年份的引用文件，仅所标年份的版本适用于本标准。凡是未标注年份的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T8321 农药合理使用准则GB/T 19378 农药剂型名称及代

3、码GB/T 31720-2015 病媒生物抗药性治理总则NY/T 3539-2020 叶螨抗药性监测技术规程NY/T 2916-2016 棉铃虫抗药性监测技术规程NY/T 2058-2014 水稻二化螟抗药性监测技术规程DB65/T 3240-2011 马铃薯甲虫抗药性监测技术规范3 术语和定义GB/T8321、GB/T 19378、GB/T 31720-2015、DB65/T 3240-2011界定的下列术语和定义适用于本标准。3.1 发生区指安徽省已有草地贪夜蛾入侵和发生分布的地区。3.2 监测点为便于比较同一地区草地贪夜蛾抗药性不同年度间的发展动态，确定相对固定的发生区作为监测点进行抗药

4、性水平监测。4 仪器、用具和化学药剂4.1 仪器和用具0-10 L微量进样器，万分之一天平，0.1-2.5 L、0.5-10 L、10 -100 L、100-1000 L移液器，1-10 mL移液管，100 mL、1000 mL量筒，500 mL烧杯，12孔培养板，光照培养箱，镊子，毛笔，皮筋，胶带，记号笔，标签纸， 1.5 mL、10 mL EP管，一次性手套等。4.2 化学药剂氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺、氟苯虫酰胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、乙基多杀菌素、茚虫威、虱螨脲、虫螨腈等2020年全国草地贪夜蛾防控预案中推荐的8种应急防治药剂的原药。5 抗药性监测5.1 监测点的确定安徽省已有草地贪夜

5、蛾入侵和发生分布的地区。具体设置原则和数量如下：5.1.1 设置原则监测点的设置根据安徽省玉米种植结构结合草地贪夜蛾入侵和发生分布特点，在长江以南、淮河以北、以及江淮之间各个地区选择草地贪夜蛾发生严重的代表性玉米种植区。5.1.2 设置数量在长江以南草地贪夜蛾迁飞过渡区选取1-2个市县、江淮之间选取2-3个市县、淮河以北草地贪夜蛾重点防治区选取3-4个市县，每个监测点面积不少于10亩。5.2 监测时间根据安徽省草地贪夜蛾的发生规律，监测时间为每年5月至10月。5.3 监测方法5.3.1 试虫的采集和饲养在确定的监测点选取代表性玉米田3-5块，每块田采用“W”型五点取样，每个监测点采集草地贪夜蛾

6、卵块200块以上，或采集幼虫、蛹500头以上，或利用诱虫灯诱集活成虫200头以上。采集的卵块孵化后，幼虫生长至3龄初，可直接用于生物测定。其他虫态室内饲养至F1代3龄初幼虫用于生物测定。饲养条件为（26±1），相对湿度为40-70%，光周期L/D= 16h/8h，幼虫采用人工饲料饲养，人工饲料的配方如附录A所示，成虫饲喂10%蜂蜜水。5.3.2 药剂的配制用电子天平准确称取一定量的杀虫剂原药，用丙酮或二甲基亚砜等有机溶剂溶解，配制成母液。如果采用饲料混毒法，可使用同一溶剂稀释母液，配制系列浓度的工作液，再与人工饲料按照质量比1:99均匀混合，药液量不少于2 g；若采用点滴法，用同一溶

7、剂将母液稀释为系列浓度的工作液，每个浓度药液量不少于2 mL；若采用浸叶法，将母液用0.1% Triton-100水溶液梯度稀释至工作液浓度，每个浓度药液量不少于400 mL。5.3.3 测定方法的选择根据防治药剂的作用特点和作用方式，选择饲料混毒法、点滴法和浸叶法等。2020年全国草地贪夜蛾防控预案中推荐的8种应急防治药剂的抗性监测推荐方法见附录D，具体实验步骤如下：5.3.3.1 饲料混毒法选取生长一致、健康的3龄初幼虫作为试虫。在24孔培养板的每孔加入适量（注：最好明确大约几克）混毒人工饲料，并接入1头试虫。12头为一个重复，每个浓度重复3次；每个药剂设置5-7个浓度梯度。以添加相同质量

8、溶剂处理的饲料作为对照。处理后将培养板转移至（26±1）、相对湿度为40-70%、光周期L/D= 16h/8h的条件下饲养。5.3.3.2 点滴法选取生长一致、健康的3龄初幼虫作为试虫。用微量点滴器将0.2 L供试药液点滴在3龄幼虫的胸部背板，从低浓度到高浓度依次处理。12头试虫为一个重复，每个浓度重复三次，每个药剂设置5-7个浓度梯度。以点滴相同体积有机溶剂的试虫作为对照。处理后的试虫转移至24孔培养板饲养，每孔1头，并加入适量人工饲料或新鲜玉米叶片，于（26±1）、相对湿度为40-70%、光周期L/D= 16h/8h的条件下饲养。5.3.3.3 浸叶法选取生长一致、健康

9、的3龄初幼虫作为试虫。采集未接触任何农药的新鲜玉米叶片，用打孔器打成直径略小于12孔培养板孔径的叶碟，浸入待测药液中10 s，取出置于吸水纸自然晾干后转至12孔培养板，每孔放入？个叶碟，接入1头试虫。12头试虫为一个重复，每个浓度重复三次，每个药剂设置5-7个浓度梯度。以含有相体积同溶剂的0.1% Triton-100水溶液处理的叶碟饲喂组为对照。处理后的试虫于（26±1）、相对湿度为40-70%、光周期L/D= 16h/8h的条件下饲养。5.3.4 药剂处理后的检查时间参照NY/T 2058-2014和DB65/T 3240-2011，根据药剂发挥作用的快慢确定检查时间。对于作用迅

10、速的杀虫剂如茚虫威、虫螨腈、氯虫苯甲酰胺、氟苯虫酰胺和四氯虫酰胺，处理后48h检查结果；甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和乙基多杀菌素处理后72 h检查结果；虱螨脲处理后96 h检查。5.3.5 试虫的死亡标准试虫触碰无反应或不能协调运动，或处理组草地贪夜蛾体长明显小于对照组体长一半以上，即判定为死亡。5.3.6 数据统计与分析5.3.6.1 数据统计将调查数据填于附录B中表格。5.3.6.2 统计分析利用SAS、SPSS、POLOplus、等软件，采用浓度对数-机率值分析法，计算LC50值及其95%置信限、斜率±标准误（b±SE）、卡方值和自由度，记录于附录C的表中。5.3.7 抗

11、性水平的判断5.3.7.1 抗性倍数的计算参照NY/T 3539-2020、NY/T 2916-2016和NY/T 2058-2014标准，计算公式如下：根据敏感品系的LC50值和监测地区种群的LC50值，按公式（3）计算监测地区种群的抗性倍数。RR=TS （3）式中：RR监测地区种群的抗性倍数；T监测地区种群的LC50值；S敏感品系的LC50值。5.3.7.2 抗性水平的评估参照NY/T 3539-2020、NY/T 2916-2016和NY/T 2058-2014标准，抗性分级标准表如下表1：表1 抗药性水平的分级标准抗药性水平等级抗性倍数RR低水平抗性5.0<RR10.0中等水平抗

12、性10.0<RR100.0高水平抗性RR>100.0 附录A（资料性附录）草地贪夜蛾人工饲料配方A.1 A组份分别称取黄豆粉100 g，麦麸80 g，酵母粉26 g，干酪素8 g，抗坏血酸8 g，加入蒸馏水500 mL充分搅拌均匀。A.2 B组份称取琼脂26 g，加入蒸馏水400 mL，充分搅拌均匀。A.3 C组分分别称取氯化胆碱1 g，山梨酸2 g，肌醇0.2 g，青霉素钠0.1 g，尼泊金甲酯2 g，加入蒸馏水100 mL充分搅拌均匀。A.4 将B组中的琼脂与蒸馏水混合物倒入烧杯中煮至沸腾，然后加入A组，继续煮至沸腾。A.5 煮沸后冷却至70-80，加入C组并搅拌均匀。A.6

13、待冷却至50-60，加入微量元素组合4 mL，并搅拌均匀。 微量元素组合 烟酰胺(Nicotianamine) 2086 mg 泛酸钙(Calcium pantothenate) 2086 mg 核黄素（Riboflavin） 1059 mg 盐酸硫胺素（Thiamine hydrochloride） 524 mg 盐酸吡哆醇（Pyridoxine hydrochloride） 524 mg 叶酸（Folic acid） 524 mg 生物素（Biotin） 51 mg 钴胺素（Cobalamin,vitamin B12） 13 mg 准确称取以上各组分，加入蒸馏水160 mL，并用玻璃棒搅拌

14、混匀，用移液枪吸取4 mL分装保存于-20备用。A.7 将配制完成的饲料倒入饲料盒（16.7cm×12.3cm×6cm）中，待饲料冷却后盖上保鲜膜，置于4冰箱保存。附录B（资料性附录）草地贪夜蛾抗性监测调查表表B.某种药剂对草地贪夜蛾生物测定原始数据表测定时间： 种群测试虫态： 测定纪录人： 药剂剂量或浓度（g/头或mg/L）重复组处理的总虫数（头）处理后的死亡虫数（头）CK123A1123A2123A3123A4123A5123A6123A7123附录C（资料性附录）草地贪夜蛾抗性监测结果表C.草地贪夜蛾抗性监测结果测定时间： 测定纪录人： 药剂种群（监测点）毒力回归线（y=a+bx）LC50及95%置信限（g/头或mg/L）斜率±标准误卡方值（自由度）抗性倍数ABCD附录D（资料性附录）草地贪夜蛾抗性监测方法的选择根据农业农业部草地贪夜蛾应急防治用药推荐名单药剂，推荐相应的生物测定方法药剂作用靶标作用方式推荐