共聚焦激光扫描荧光显微镜

1、.共聚焦激光扫描荧光显微镜共聚焦激光扫描荧光显微镜 基本原理、应用及样本制备原则基本原理、应用及样本制备原则宋 健武汉大学医学院结构生物学研究中心武汉大学医学院结构生物学研究中心Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine. 什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜（共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚

2、焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统荧光显微镜系统共聚焦系统共聚焦系统 细胞细胞CT .荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光激发光( (EXCITATION)EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围

3、内的光线称为该荧光素的激发光。光线称为该荧光素的激发光。激发激发/ /吸收光谱吸收光谱；吸吸收波峰收波峰( (最大吸收波长最大吸收波长) )488nm 520nm异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)发射光发射光( (EMISSIONEMISSION):): 发射光谱；发射波峰发射光谱；发射波峰( (最大发射波长最大发射波长) )荧光探针：荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光自发荧光( (AUTOFLUORESCENCE):AUTOFL

4、UORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白漂白( (BLEACH)BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。漂白。.二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 带通滤色镜带通滤色镜( (BP)BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜

5、组合长、短通滤色镜组合（LP LP + + KPKP）：）：LP450 + KP490LP450 + KP490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：阻断滤镜：多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490LP490紫外紫外蓝蓝绿绿高高压压汞汞灯灯被荧光被荧光探针染探针染色的生色的生物样本物样本激发激发被标记被标记结构的结构的荧光光荧光光学图像学图像光学光学成像成像滤镜滤镜分光分光488nm 520nmFITC450nm 490nm.共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置Laserand electronicControl Unit激光光源及

6、激光光源及控制装置控制装置Computer计算机计算机Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜荧光显微镜Anti-vibration table防震台防震台Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System.共聚焦装置共聚焦装置光源光源针孔针孔检测检测针孔针孔荧光显微镜荧光显微镜光电倍增管光电倍增管步进聚焦电机步进聚焦电机物镜物镜Bio-Rad LaserSharp 系统操作，图像处理系统操作，图像处理3-D重建重建X/Y扫描扫描装置装置.光电倍增管光电倍增管检测针孔检测针孔

7、光源针孔光源针孔光源光源分色镜分色镜物镜物镜样本样本聚集平面聚集平面共聚焦扫描显微镜光学原理共聚焦扫描显微镜光学原理 检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔入检测针孔 高分辨率的光学切片高分辨率的光学切片 激光穿透性强激光穿透性强，可可对样本进行一定深对样本进行一定深度度光学光学断层，获得高标准的连续光学切片断层，获得高标准的连续光学切片 实现三维重建实现三维重建.三维胶原基三维胶原基质培养的血质培养的血管平滑肌细管平滑肌细胞胞.共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域共聚焦激光扫描荧光显微镜应

8、用领域 只要目的结构是用荧光探针标记的，都可只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的细胞凋亡、中枢神经系的F F联联系、肿瘤细胞分类系、肿瘤细胞分类 分子生物学：分子生物学：原位杂交，原位杂交，DNADNA、RNARNA定量，定量，DNADNA损伤修复、损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、外源性基因在真核细胞的表达、定位定位，荧光能量共振转移荧光能量共振转移大分子构象的改变大分子构象的改变、受体与配体相互作用、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：活细胞动态荧光测量：细胞内细胞内Ca

9、Ca+、K K+ +、H H+ +等离子的动态分布及动态定量、等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白.IntensityBefore bleach After bleach 90 min after bleach1. 荧光漂白恢复荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递.2. 荧光能量共振转移荧光能量共振

10、转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer)I. .荧光能量共振转移荧光能量共振转移: : 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光供体荧光素素，能量的接受者叫，能量的接受者叫受体荧光素受体荧光素。供体荧光素供体荧光素 受体荧光素受体荧光素1.1.供体与受体间的距离供体与受体间的距离 10nm或或=1-7nm2.2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠有实质

11、性的重叠II. .荧光能量共振转移的条件荧光能量共振转移的条件488nm 520nm 650nm540nm 650nm488nm 520nm供体荧光素供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素受体荧光素 (Cy3)供体荧光素供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素受体荧光素 (Cy3).FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFPFluorescence Fluorescence IntensityIntensityTime 检测检测 以供体的激发波长的光照射样品以供体的激发波长的光照射样品, ,没有共没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体

12、的荧光减弱，受体被激发出现转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。荧光。应用应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合受体与配体的相互作用：亚基的结合 与分离与分离 大分子构象的改变大分子构象的改变LigandCy3Cy5Cy5III. 常用荧光共振转移探针对常用荧光共振转移探针对.3. 绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFP） GFP的发现的发现：60年代，年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经

13、证实在水母体内还存在另外一种发光蛋母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。）。GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒商品化质粒转基因动物转基因动物: Green mouse外源基因的报告基因外源基因的报告基因: : 将外源基因与将外源基因与GFP DNA 相连相连, , 可实时监可实时监测外源基因的表达测外源基因的表达. .检测细胞能否表达某一基因检测细胞能否表达某一基因: : 将待测基因的启动子与将待测基因的启动子与GFP DNA 相连相连, , 可实时监测细胞

14、能否表达兴趣基因可实时监测细胞能否表达兴趣基因. .1.GFP-蛋白融合技术蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与将结构蛋白基因与GFP DNA 相连相连可实时监可实时监测测结构蛋白结构蛋白的表达的表达亚细胞亚细胞结构的形成结构的形成蓝色荧光蓝色荧光 GFP 绿色荧光绿色荧光 Ca2+ 肠腔素肠腔素Aequoren +.原理原理: 检测游离检测游离Ca2+变化的荧光探针多为变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与胞膜，只有与乙酰甲酯乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内相连方可进入细胞内, 被细胞内被细胞内酯酶酯酶水解后水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。方

15、能与胞内游离钙结合后发出荧光。 Kd值：值：为为CaCa2+2+解离常数，指示检测解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围浓度的范围: : 0.1xKd-10 xkd 和很多因素有关（和很多因素有关（pHpH、 Mg Mg2+2+、温度、与蛋白的结合、等）温度、与蛋白的结合、等） 细胞内生理细胞内生理CaCa2+2+浓度值：浓度值：10-10010-100nMnM 细胞内细胞内CaCa2+2+超载浓度值：基础超载浓度值：基础CaCa2+2+浓度的浓度的1010倍左右倍左右 4. 活细胞内离子动态变化测量活细胞内离子动态变化测量细胞内游离细胞内游离Ca2+测量测量 荧光探针荧光探针 激发波长激发波长

16、 发射波长发射波长 KdCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMFLuo3-AM, 464nm 526nm 390nMFura red 420/480nm 637nm 140nM.KCL诱导的细胞外诱导的细胞外Ca+内流测量内流测量培养培养/ /分离的细胞分离的细胞 20 M Fluo 3-AM负载液负载液30-60min 清洗、换液清洗、换液 扫描扫描KCLKCL若须快速测量若须快速测量1.改变扫描速度改变扫描速度2.采用双向扫

17、描采用双向扫描3.减少采样点数减少采样点数(牺牲空间分辨率）牺牲空间分辨率）4.采用线扫描采用线扫描(xt)KCLKCL.双光子双光子激光扫描荧光显微系统激光扫描荧光显微系统 照射光波长大于荧光照射光波长大于荧光染料吸收峰波长染料吸收峰波长2倍倍 高能量高能量(2KW)、超短超短脉冲脉冲(兆分之一秒兆分之一秒)聚焦聚焦, 使聚焦点瞬间产生高密使聚焦点瞬间产生高密度光子度光子, 出现双光子吸收出现双光子吸收激发荧光激发荧光 双光子吸收仅发生在双光子吸收仅发生在聚焦点聚焦点, 避免了焦点外激避免了焦点外激发而产生的漂白现象发而产生的漂白现象高能量、超短脉冲聚焦高能量、超短脉冲聚焦、穿透性更强、穿透

18、性更强 50 m 500 m 488nm 520nmFITC976nm.共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则400450500550600650700750800EXCITATION and EMISSION SPECTRAEXCITATIONEMISSION Cy2 Cy3 Texas Red Cy5 Cy5.5INTENSITY arb. unitsWAVELENGTH nmFITCRhodamine1.常用荧光素的特性常用荧光素的特性.2. 荧光探针的选择荧光探针的选择原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。标记要求标记要求荧光素选择荧光素选择/组合组合核复染核复染单标单标 无特殊限制。 FITC, Cy2最佳；尽量不选择Cy5, Cy5.5（红外) 与自发荧光自发荧光冲突时，采用Texas Red 。Propedium Iodide (PI) / DAPI双标双标FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必须顺序扫描)DAPI (必须必须顺序扫描顺序扫描)三标三标FITC/Cy2 + TEXAS RED + Cy5.5FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必须顺序扫描)活细胞追踪活细胞追踪 能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞