定量蛋白组学-百替生物ppt课件

1、定量蛋白组学定量蛋白组学Kita; 从基因组学到蛋白质组学从基因组学到蛋白质组学 -人类迈入后基因组时代人类迈入后基因组时代;基因组方案的局限： 4060%的基因编码的蛋白质的功能是未知的。基因组研讨的局限性 常规大规模基因表达检测技术，无法准确反映蛋白质的质与量，组织中mRNA的丰度与蛋白质的丰度并不完全一样。由于基因到蛋白质存在三个层次的调控；蛋白质复杂的后修饰无法从mRNA程度来判别。;蛋白质组学蛋白质组学 最早是由最早是由Marc Wilkins在在2019年提出的，源于蛋白年提出的，源于蛋白Protein与基因组学与基因组学Genomics两个词的组合，两个词的组合，意指意指“一种基

2、因组所表达的全套蛋白质，即包括一一种基因组所表达的全套蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 蛋白质组学本质上指的是在大规模程度上研讨蛋白蛋白质组学本质上指的是在大规模程度上研讨蛋白质的特征，包括蛋白质的表达程度，翻译后的修饰，质的特征，包括蛋白质的表达程度，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质程度上的关蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质程度上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。; 对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内一切蛋白质进展准确鉴定和定量。可用于

3、挑选和寻觅任何要素引起的样本之间的差别表达蛋白，结合生物信息学提示细胞生理病理功能，同时也可对某些关键蛋白进展定性和定量分析定量蛋白质组学定量蛋白质组学(Quantitative Proteomics);定量蛋白质组学技术定量蛋白质组学技术Spectral counts In vitroIn vivoPeak areaSILAC/15N ICAT/iTRAQ;双向电泳技术双向电泳技术 Two-dimensional electrophoresis 原理：利用蛋白质的等电点原理：利用蛋白质的等电点pI)和分子量和分子量(Mr)不同而分别不同而分别蛋蛋 白质。白质。第一向电泳：等电聚焦第一向电泳：

4、等电聚焦Isoelectric Focusing，IEF根据蛋根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分别；白质的等电点不同将蛋白质分别；第二向电泳：十二烷基硫酸钠第二向电泳：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS PAGE利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分别。分别。; 双向电泳流程双向电泳流程 基于2D-PAGE的经典定量分析方法。 1、样品预备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋白质分别：蛋白质经过2D-PAGE分别后染色银染、考染等。 3、蛋白质的定性与定量分析：经过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差别点

5、，质谱鉴定差别点蛋白质,同时运用软件分析出其表达量的变化。;缺陷： 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、 极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分别。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。 敏感性和准确低;常见的同位素标志技术常见的同位素标志技术化学标志法：化学标志法： 1ICAT法同位素亲和标签技术，法同位素亲和标签技术，isotope- coded affinity tags 2iTRAQ法法 isobaric tags for relative and absolute quantitation 代谢标志法：代谢标志法：115N标志法标志法2细胞培育中含有稳定

6、同位素的氨基酸标志法细胞培育中含有稳定同位素的氨基酸标志法 SILAC);ICAT 试剂有三部分组成，有两种方式，称为“重和“轻重型含8个氘轻型不含氘。第一第一 亲和标签生物素，用亲和标签生物素，用来分别经标志后的多肽；来分别经标志后的多肽；第二第二 衔接子，用来整合稳定的衔接子，用来整合稳定的同位素；同位素；第三第三 活性基团，用来特异结合活性基团，用来特异结合巯基。巯基。同位素亲和标签技术同位素亲和标签技术ICAT法，法，isotope-coded affinity tags;ICAT标志定量技术流程标志定量技术流程两种蛋白质分别用重型两种蛋白质分别用重型ICATICAT试剂和轻型试剂和轻

7、型ICATICAT试剂标志试剂标志标志后等量混合，胰蛋白酶标志后等量混合，胰蛋白酶酶切酶切亲和纯化得到亲和纯化得到ICATICAT标志的多标志的多肽肽质谱分析，根据质谱分析，根据MSMS质谱峰图质谱峰图强度进展定量，强度进展定量，MS/MSMS/MS鉴定鉴定肽段肽段;ICAT法的缺陷法的缺陷 1它不能用于标志不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 2ICAT分子量相对较大约500Da与蛋白质衔接后能够会呵斥分子的空间位阻对小肽而言是一个较大的修饰物，会添加数据库搜索的复杂性;同重标签标志的相对和绝对定量同重标签标志的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and

8、absolute quantitation，iTRAQ)由美国ABI公司2019年开发的新技术。;iTRAQ试剂标志原理试剂标志原理 报告部分：共有8种：质量数分别为114121Da，最多可同时标志8组样品。 肽反响部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价衔接，从而将报告部分和平衡部位标志到肽段上。 平衡部分：质量数分别为3124Da，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标志的不同样本的同一肽段具有一样的质荷比。; iTRAQ试剂是可与氨基包括氨基酸试剂是可与氨基包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基端及赖氨酸侧链氨基衔接的胺标志同重元素。在一级质谱图中，任何一种衔接的胺标志同重元素。在一级质谱图中，

9、任何一种iTRAQ试剂试剂标志不同样本中的同一蛋白质表现为一样的质荷比。标志不同样本中的同一蛋白质表现为一样的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的一样肽段表现为一个峰；在二级在一级质谱中，不同来源的一样肽段表现为一个峰；在二级质谱中，质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丧失，信号离子表现试剂中的平衡基团发生中性丧失，信号离子表现为不同质荷比为不同质荷比(114121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差别；同时，肽段的得到同一蛋白在不同样本中的表达差别；同时，肽段的MS/MS结结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。果

10、结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。;iTRAQ实验流程实验流程1：搜集不同组别的样本并分 别提取蛋白质； 2：蛋白质经过复原，封锁 后用胰蛋白酶酶切； 3：各组样本的肽段混合物分别 用不同的iTRAQ试剂标志； 4：等量混合各样本中的标志肽 段； 5：MS/MS质谱检测及分析。 ;iTRAQ 技术优势技术优势 灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；灵敏度高：可检测出低丰度蛋白； 分别才干强分别才干强:可分别出酸可分别出酸/碱性蛋白，小于碱性蛋白，小于10KD或大于或大于200KD的蛋白、难的蛋白、难溶性蛋白等溶性蛋白等 适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进展鉴定，包括膜蛋白、核蛋适用范围广：可以

11、对任何类型的蛋白质进展鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。白和胞外蛋白等。 高通量：可同时对高通量：可同时对8个样本进展分析，特别适用于采用多种处置方式或个样本进展分析，特别适用于采用多种处置方式或来自多个处置时间的样本的差别蛋白分析；来自多个处置时间的样本的差别蛋白分析； 结果可靠：定性与定量同步进展，同时给出每一个组分的相对表达程结果可靠：定性与定量同步进展，同时给出每一个组分的相对表达程度、分子量和丰富的构造信息；度、分子量和丰富的构造信息； 自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分别效果好。自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分别效果好。;Label-free

12、指无标签标志的定量蛋白质组学研讨，依赖于繁杂的信息分析完成定量过程，主要有两种： 信号强度法：根据一级质谱相关的肽段峰强度Mass spectral peak intensity、峰面积Peak area、液相色谱保管时间LC retention time等信息进展定量分析； 谱图计数法 ：根据二级质谱相关的每个蛋白鉴定到的肽段总次数Peptide hide或Spectral counts、所鉴定肽段的离子价位Ion counts of identified peptides等信息进展定量分析。; 将质谱数据由谱峰方式转化为直观的类似双向凝胶的图谱，谱图上每一个点代表一个肽段，再比较不同样本相

13、应肽段的强度，从而对肽段对应的蛋白质经行相对定量。; 优点：优点： 无标志定量技术与同位素标志定量技术相比，无标志定量技术与同位素标志定量技术相比，实验本钱低，不需求购买昂贵的同位素标志试剂。实验本钱低，不需求购买昂贵的同位素标志试剂。 缺陷：缺陷： 不能将不同样品同时进展质谱分析，实验操作不能将不同样品同时进展质谱分析，实验操作比较繁琐。需求更高的数据分析处置方法。比较繁琐。需求更高的数据分析处置方法。;代谢标志法代谢标志法15N标志法标志法简介：简介： 在培育基中添加在培育基中添加15N15N，细胞经过假设干代培育后，蛋白，细胞经过假设干代培育后，蛋白质将完全被同位素标志，等量混合标志与没

14、有标志同位素质将完全被同位素标志，等量混合标志与没有标志同位素的样本、液相色谱和的样本、液相色谱和SDS-PAGESDS-PAGE分别，质谱鉴定和定量。分别，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判别出同一肽段根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判别出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进展序列在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进展序列测定从而鉴定蛋白质。测定从而鉴定蛋白质。; 优点：优点： 高效性：高效性：15N15N标志法是体内标志技术，标志效率可高达标志法是体内标志技术，标志效率可高达95%95%； 重现性：降低由于样品制备不同而呵斥的实验内差别；重现性：降

15、低由于样品制备不同而呵斥的实验内差别； 灵敏性：在培育基中添加同位素标志灵敏性：在培育基中添加同位素标志15N 15N ，操作方便。，操作方便。 缺陷：缺陷： 1 1只需知蛋白质的氨基酸序列，才可以对只需知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N14N/15N标标志的蛋白质或肽段的相应质量位移进展预测。志的蛋白质或肽段的相应质量位移进展预测。 2 2由于运用的由于运用的15N15N培育基纯度培育基纯度96%96%，无法完全置换，无法完全置换14N,14N,所以所以15N15N标志的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。标志的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。;SILAC 即细胞培育条件下稳定同位素标

16、志技术即细胞培育条件下稳定同位素标志技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC) 原理是在细胞培育时，采用含有轻、中、重原理是在细胞培育时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培育基进展细胞培育，用同位素型必需氨基酸的培育基进展细胞培育，用于于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是主要的稳定同位素氨基酸是Lys和和Arg, 细胞在传代培育过程中同位素氨基酸将被细胞用细胞在传代培育过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培育于合成蛋白质，细胞经传代培育5-6代后，细胞的代后，细胞的一切蛋白质将被同位

17、素标志，等量混合标志的蛋一切蛋白质将被同位素标志，等量混合标志的蛋白质后经过白质后经过SDS-PAGE分别和质谱分析，经过比分别和质谱分析，经过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进展相对定量，同时二级谱图对肽段进展序列测定展相对定量，同时二级谱图对肽段进展序列测定从而鉴定蛋白质。从而鉴定蛋白质。;代谢标志法代谢标志法SILAC 1、标志：在缺乏Lys和Arg的培育基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培育细胞，使蛋白质被标志成“中型或“重型； 2、细胞处置，如药物处置； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处置组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条