广州大学生物工程下游技术实验(糖化酶的固定化)

1、糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺研究摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与固定化条件之间的关系。本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨影响固定化糖化酶稳定性及结合牢固程度的因素和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其催化效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化的效果较好；糖化酶经过固定后，其稳定性显著增加；重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。 关键词：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力1、前言：糖化酶也称葡萄糖淀粉酶（gluco

2、amylase, EC.3.2.1.3）(淀粉-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能够催化淀粉液化产物-糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖。糖化酶对底物的作用是由非还原端开始，将-1，4-键和-1，6键逐一水解，酶作用时糖苷键在C1-6间断裂，所产生的葡萄糖为b构型，几乎100%转变为葡萄糖。工业生产使用的糖化酶主要来自曲霉、根霉及拟内孢霉，它被广泛应用于酿酒、制糖等行业，是非常重要的酶制剂。酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法（结晶法、分散法、物理吸附法及离子结合法）；化学结合法（包括共价结合法及交联法）；包埋法（包括微囊法及网络法）。本实验利用离子结合

3、法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：葡聚糖凝胶、离子交换树脂、纤维素等。本实验以离子交换树脂为载体，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，酶的活性回收率高，可反复连续生产，对稀酶有浓缩作用，载体可再生使用。其缺点是：载体和酶的结合力弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在高离子强度下进行反应时，酶易从载体上脱落。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较

4、高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。2、材料与方法：2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6缓冲液)，无水乙醇，盐酸。硫代硫酸钠（0.05M），碘溶液（次碘酸钠，0.1M）。硫酸2M,（2）酶液、固定化酶及固定化后的残留酶液2.2实验仪器：恒温水浴锅（可达99，5个），酸度计（3个），容量瓶，量筒，烧杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，锥形瓶，试管架，吸耳球，pH试纸，滤纸，离心机，离心管，

5、分光光度计等。2.3试剂：（1）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O

6、 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。2.4操作步骤：2.4.1.试剂的配制：1）糖化酶液：市售商品化糖化酶,去离子pH7的磷酸缓冲液配制，根据标称的活力单位配制为1万单位/ml的溶液，离心去除不溶性杂质，共配4000ml, 4备用。2mol/L氢氧化钠：8gNaOH-100ml,共配3000ml，2mol/LHCL:17ml浓盐酸-100ml，共配3000ml，2.4.2固定化酶实验步骤：载体的预处理：A：乙醇处理

7、：15克湿离子交换剂-50ml烧杯加入30ml去离子水，搅拌，倒去水。注入2倍体积无水乙醇，乙醇浸泡过夜（12h），然后用去离子水连续冲洗以除去乙醇。B：碱处理：2倍体积（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分搅拌，再以去离子水冲至pH6.0-7.0C：酸处理:用2倍体积的2mol/L HCl溶液处理阴离子交换树脂，然后用去离子水洗至pH6.0。D：重复B固定化酶实验：酶的固定化：100ml糖化酶液倒入贮液槽中，加入预处理的离子交换剂，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化，30min后过滤去未固定的酶液，测量固定化酶及反应后残留酶液活性。2.4.3麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管（

8、可用封口胶代替），编号，按表1加入试剂：表1 葡萄糖标准曲线制作试 剂管 号1234567葡萄糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸馏水（mL）2.01.81.41.00.60.20葡萄糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2.4.4 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。表2 酶活力测定取样表操 作

9、 项 目 淀粉酶活力测定 固定化酶活力测量 1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0预保温 将各试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min淀粉酶原液（） 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.2g 0.2g 0.2g（1，4二个空白，原酶空白和固定化酶空白的酶预先煮沸失活） 保温 在40恒温水浴中准确保温5min取反应液0.1ml,加入1.9ml水，迅速加入以下DNS3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线（煮沸，定容）。根据以上反应吸光值的大小调整显色时加入

10、的反应液的量，再加DNS显色，目的是使其达到合理的吸光值，以后者为准计算酶的活力。2.5固定化酶稳定性及牢固程度研究方法2.5.1固定化酶稳定性研究方法（1）制备固定化糖化酶。 （2）取6支有刻度的试管，编号，分别称取3份0.4g的固定化糖化酶，倒入试管中。（3）分别测量固定化糖化酶和糖化酶未放入恒温水浴锅前的活力。（4）将3支装有固定化糖化酶的试管和1支装有5ml天然糖化酶的试管放入60恒温水浴锅中，保温。（5）每隔30min分别测量一次固定化糖化酶和糖化酶的酶活，工测量2次。2.5.2固定化酶结合牢固程度研究方法取测量固定化糖化酶活力时的试管，用滤纸过滤，继续放入40恒温水浴锅中保温，隔2

11、0min测量一次酶活，测量2次。2.6固定化糖化酶生产葡萄糖工艺研究方法（1）制备固定化糖化酶。（2）取30ml淀粉溶液，迅速倒入贮液槽中，控制其流出速度为1ml/min，用烧杯接流出的葡萄糖液。测其葡萄糖含量。（3）重复步骤（2）。2.7结果计算在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量（mg），按下列公式计算酶的活力。酶活力单位（U）1 mg葡萄糖产生量/min酶活力单位的定义：在55C，pH4.6的条件下，在上述反应体系中水解可溶性淀粉产生1mmol葡萄糖，即为一个酶活力单位。对固定化酶以mmol/(min.mg)表示（或U/( mg)）；对液相酶以U/ml或mmol/(min.ml)表示。活力回

12、收=固定化酶总活力/加入酶总活力*100%偶联率=载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%相对活力=固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%计算第二次重复使用固定化酶的生产效率为第一次使用的百分比3、结果与讨论：3.1葡萄糖标准曲线表1 葡萄糖标准曲线制作（葡萄糖含量/mg）试管号1234567A54000.0340.2060.3570.4530.6630.751图1 葡萄糖标准曲线3.2酶活力测定表2 淀粉酶催化淀粉产生葡萄糖分光值试管号123A54000.5630.623表3 固定化酶催化淀粉产生葡萄糖分光

13、值试管号123A540002200.241表4 残留酶液催化淀粉产生葡萄糖分光值试管号123A54000.0210.023数据处理：（1）淀粉酶（原酶）：试管1：葡萄糖的含量：(0.563+0.0238)/0.3758*110=171.76mg 每ml酶液酶活力单位（U）：171.76/5=34.35试管2：葡萄糖的含量：(0.623+0.0238)/0.3758*110=252.02mg 每ml酶液酶活力单位(U)：252.02/5=50.4030ml样品酶活力单位（U）：（34.35+50.40）*30/2=1271.25（2）固定化酶：试管1：葡萄糖的含量：(0.220+0.0238)/

14、0.3758*110=71.36mg 每ml反应液酶活力单位（U）：71.36/5=14.27试管2：葡萄糖的含量：(0.241+0.0238)/0.3758*110=77.51mg 每ml反应液酶活力单位（U）：77.51/5=15.500.2g样品酶活力单位（U）：（15.50+14.27）/2=14.89（3）残留酶液试管1：葡萄糖的含量：(0.021+0.0238)/0.3758*110=13.11mg 每ml酶液酶活力单位（U）：13.11/5=2.62试管2：葡萄糖的含量：(0.033+0.0238)/0.3758*110=16.63mg 每ml酶液酶活力单位(U)：16.63/5

15、=3.3328ml样品酶活力单位（U）：（2.62+3.33）*28/2=83.3活力回收: 固定化酶总活力/加入酶总活力*100%=（14.89*15.2*5）/1271.25*100%=89.02%相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%=（14.89*15.2*5）/（1271.25-83.3）*100%=95.26%偶联率：（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%=（1271.25-83.3）/1271.25*100%=93.45%分析以上所得结果可知：固定化化酶的活力回收为89.02%，偶联率为93.45%，相对活力为95.26%

16、，由于固定化后酶的偶联率达到93.45%，证明该次实验中，固定化的效果较好，活力回收和相对活力较大。3.3固定化酶的稳定性表5 天然酶与固定化酶催化淀粉产生葡萄糖分光值天然酶固定化酶试管号1212A5400.5530.6210.4550.491表6 30分钟后天然酶与固定化酶催化淀粉产生葡萄糖分光值天然酶固定化酶试管号1212A5400.5420.6020.4400.470数据处理：（1） 30分钟前天然酶：试管1：葡萄糖的含量：(0.553+0.0238)/0.3758*110=168.83mg 每ml酶液酶活力单位（U）：168.83/5=33.77试管2：葡萄糖的含量：(0.621+0.

17、0238)/0.3758*110=188.74mg 每ml酶液酶活力单位(U)：188.74/5=37.7530ml样品酶活力单位（U）：（33.77+37.75）*30/2=1072.80固定化酶：试管1：葡萄糖的含量：(0.455+0.0238)/0.3758*110=140.15mg 每ml反应液酶活力单位（U）：140.15/5=28.03试管2：葡萄糖的含量：(0.491+0.0238)/0.3758*110=150.69mg 每ml反应液酶活力单位(U)：150.69/5=30.140.2g样品酶活力单位（U）：（28.03+30.14）/2=29.09（2） 30分钟后：天然酶：

18、试管1：葡萄糖的含量：(0.542+0.0238)/0.3758*110=165.21mg 每ml酶液酶活力单位（U）：165.21/5=33.12试管2：葡萄糖的含量：(0.602+0.0238)/0.3758*110=183.18mg 每ml酶液酶活力单位(U)：183.18/5=36.6430ml样品酶活力单位（U）：（33.12+36.64）*30/2=1046.4固定化酶：试管1：葡萄糖的含量：(0.440+0.0238)/0.3758*110=135.76mg 每ml酶液酶活力单位（U）：135.76/5=27.15试管2：葡萄糖的含量：(0.470+0.0238)/0.3758*

19、110=144.54mg 每ml酶液酶活力单位(U)：144.54/5=28.910.2g样品酶活力单位（U）：（27.15+28.91）/2=28.03（3）活力变化速度天然酶：（1072.8-1046.4）/30=0.88U/min14.91g固定化酶：（29.09-28.03）*14.91*5/30=0.527 U/min分析表中数据可知：在相同时间内，原酶酶活的下降速度比固定化酶的下降速度快，证明糖化酶经过固定后，其稳定性显著增加。3.4葡萄糖生产效率表7 固定化酶重复生产葡萄糖效率分光值批次第1批第2批第3批体积（ml）252625A5400.5420.2160.023数据处理：第1批：样品葡萄糖含量：(0.542+0.0238)/0.3758*10=15.6mg 总葡萄糖含量：165.61*25=376.40mg 葡萄糖生产效率：376.40/30/1.2=10.46mg/min第2批：样品葡萄糖含量：(0.216+0.0238)/0.3758*10=6.38mg 总葡萄糖含量：6.38*26=165.91mg 葡萄糖生产效率：165.9