黄芩苷 黄芩素论文(终稿)

1、武汉轻工大学毕业设计（论文）论 文 题 目：UPLC法测定黄芩提取物中黄芩苷和黄芩素的含量Determination of BaicaLin and BaicaLein inScuteLLarein by UPLC method2015年6月武汉轻工大学学士论文目 录摘 要1Abstract2第一章 绪论31. 黄芩的研究进展31.1黄芩的药理作用31.2 黄芩的有效成分41.3黄芩的检测方法42. 研究内容73. 研究意义73.1禽类73.2 猪83.3 反刍动物8第二章 实验研究101. 材料方法101.1 实验材料101.2 实验方法102方法学验证122.1 系统适应性122.2 标准

2、曲线及线性关系考察132.3精密度试验142.4稳定性试验152.5重复性试验152.6加标回收率的测定163黄芩的提取液含量测定164 讨论165 试验方法的优缺点175.1 缺点175.2 优点18参考文献19致 谢21摘 要建立用超高效液相色谱（UPLC）同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素的方法。方法:将适量黄芩提取液溶于甲醇，于100mL容量瓶中定容，配成黄芩供试品溶液。检测方法：Waters 超高效液相色谱仪，色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18 (2.1×50mm ,1.7um) ，流动相为乙腈（流动相 C），0.05% 磷酸（流动 D ）；00.68mi

3、n ,30%C,70%D；0.681.02min,30%40% C,70% 60%D;1.021.36min ，40% 65% C，60% 35% D;1.362.30min,30%C ,40%D的梯度洗脱。流速为0.61mL/min，柱温30，紫外检测波长为278nm，进样量为0.02µL。结果：本方法线性范围为：黄芩苷6.496µg/mL（r=0.999），黄芩素3.248µg/mL（r=0.9991）。 结论：本方法操作简便、准确、线性关系良好、分析时间短，能同时检测黄芩中两种有效成分（黄芩苷和黄芩素），适用于各种黄芩的质量控制。关键词：黄芩苷；黄芩素；超高

4、效液相色谱法；含量测定 AbstractAbstract：To estabLish a UPLC method for the simuLtaneous determination of baicaLin, baicaLein in ScuteLLaria baicaLensis. Methods：dissoLve appropriate amounts of ScuteLLarein extracting soLuton into MethanoL. thus getting the ScuteLLarein tested soLution. Determination methods:UP

5、LC anaLysis of target compounds was conducted on a Waters UPLC system with ACQUITY UPLC®BEH C18 (2.1×50mm ;1.7um).The mobiLe phase was composed of acetronitriLe (soLvent C) and 0.05% phosphoric acid (soLvent D),and the foLLowing gradient was used: 00.68min, 30% soLvent C,70% soLvent D ;0.6

6、81.02 min,30%40% soLvent C,70% 60% soLvent D ;1.022.30min, 30% soLvent C, 40% soLvent D. ALso the foLLowing rate of the foLLowing phase is 0.61mL/min. A 0.02 µL sampLe and a standard soLution were individuaLLy injected into the chromatographic system. The temperature of the coLumn was maintaine

7、d at 30 , and the eLuent was monitored at 278 nm. The quantities of the BaicaLin and BaicaLein were caLcuLated by comparing the peak areas to those of the standards . ResuLts：The Linear reLationship was in the range of 6.4 to 96 g/mL (r = 0.999) for，BaicaLin，and the range of 3.2 to 48g/mL（r=0.9991）.

8、ConcLusion：The method is simpLe, accurate, good Linearity and time saved，and can determine two effective compounds in ScuteLLarein，thus the method can be used to controL the quaLity of the sorts of pharmaceuticsKey Words ：BaicaLin; BaicaLein; UPLC; Content Determination第一章 绪论1. 黄芩的研究进展1.1黄芩的药理作用黄芩是一

9、种多年生长草本的植物也是一种重要的传统中药，高度约为2060cm。生长稚嫩的黄芩在根的内部是实心的，而生长时间比较长的老根则是空心的，里面会出现一条空隙，一条主系根非常的粗壮，与圆锥的形状差不多，最表层的的外部皮是比较暗的褐色，但是内部的颜色是黄色。当黄芩的生长到幼年时期基部的叶茎开始分支，茎叶的形状与四棱形的形状相似。叶子对称生长，与披针形状是一样的，全缘的长度约为13厘米，叶子的表面呈现出深绿色，背面则为淡淡的绿色，非常漂亮，叶柄极短或者没有叶柄。顶端有一个非常大的花絮，花絮偏向枝的另一端，花瓣的呈现出苞片的形状像两片唇形，上部分的唇冠向上突起，花冠特别大，前部的花冠紫色比较深，连接茎叶部

10、分的花瓣颜色比前面的略淡，有点偏白色。黄芩的小坚果近乎为圆形，黑色的果实，根呈圆锥形状，销弯曲，因生长年限长短不同，故黄芩的形状大小不等。中年生长的黄芩的根部大约为1030cm，直径约为14cm,药材的头部出现炸裂的形式，表明老根中心部位己经枯萎。像这种比较老的根，它的外表是棕黄色的残留部分的的皮比较粗糙，就像那种沟沟壑壑的支条痕迹。质硬而脆易折断。断面非常不平坦。遇潮湿或者冷水会慢慢的变为绿色。没有明显的气味，黄芩味苦。我们一般认为根部长，而且非常坚硬，皮的表面光滑，内部结构颜色为黄色的是最好的，这些唇形科药用植物黄芩经人工风干黄芩药材根有非常高的药用价值，日常生活中处理工序比较好的的这种药

11、材售价是非常贵的。黄芩的药性呈现出寒凉，补肝肾，在传统中药里，黄芩广泛应用于轻微发炎、癌症、鼻出血症状、肝炎腹泻不止、子宫内出血、心血管机能障碍、上呼吸道感染和胃肠感染的治疗，具有去火的疗效，降低人体内的毒素，还有润燥增湿的功能，能降低胆固醇含量的水平，长期服用可以缓慢降低高血压，治肺热止咳嗽、治温去热病，还有对于肺炎、咳血、痢疾、湿热黄胆、胎动不安等症状非常有效，最近的研究显示表明黄芩具有抗肿瘤的效应， 目前研究表明黄芩在抵抗肠道有害细菌的感染，以及改善肠道菌群失调等方面有良好的作用，因此在目前人药市场上黄芩主要作为肠道疾病药物，治疗慢性气管炎，治疗小儿急性呼吸道感染，治疗传染性肝炎，治疗肾

12、炎、肾盂肾炎，治疗高血压病等疾病。1.2 黄芩的有效成分黄芩主要含五种有效成分分别为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类化合物。黄芩主要发挥药理作用的有效成分是黄芩苷（图1）和黄芩素（图1）。黄芩提取物中富含类黄酮成分，例如：黄芩苷和黄芩素，由于其治疗效应，包括其抗肿瘤、护肝、抗菌、抗炎、抗氧化作用，对甲型流行性感冒病毒PR3有抑制作用、溶剂对多种皮肤真菌有不同程度的抑制作用、此外，黄芩能使体内的血糖含量上升，并有利胆、明目、抑制肠管没有必要的生理机能的运动、加强肠胃的蠕动和抗过敏的作用。一定程度上可以降低心血管疾病，类黄酮化合物已经得到了相当多医学家的焦点关注。 在这些组分中，黄芩苷和

13、黄芩素具有广泛的生物效应且低毒的特点，因此在制药过程中，应改进提取工艺，以获取更多的黄芩苷和黄芩素。黄芩素黄芩苷图1 1.3黄芩的检测方法取物的成分组成复杂，并且存在其他干扰成分，有关定量分析中药生物活性成分的各种方法多见报道。我们以前研究类黄酮化合物的工作者一般用高效液相色谱、液相色谱-质联联用（LC-MS）超高效液相色谱（UPLC）、紫外分光光度法定性定量的分析方法来测量各种基质中类黄酮的含量。1.3.1 紫外分光光度法此种方法的条件使用一定频率的紫外光线可见光照射黄芩苷，从而引起黄芩分子中的中价电位的电子跃迁，此方法将会有选择地被吸收物质。随着吸收波变化的光谱。从仪器中显示出一个特定的试

14、样特征，在一个不变的波长下，紫外可见的范围内 ，以吸收的程度为X轴，以已知的为Y轴，可以发现，吸收的程度正比于成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析。蔡越秀采用此法测定黄芩里面黄芩苷的含量，结果显示表明该方法方便快捷简单，可供黄芩苷质量控制用。1.3.2液相色谱质谱联用（LCMS）将液相色谱的分离物质能力与质谱的定性分析功能相结合起来就是色谱质谱联用，一定条件下可以对准确定量、定性黄芩中的黄酮类混合物。而且也省略了一系列样品处理过程，使实验的定性定量更方便更简洁，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的黄酮类复杂的化合物。1.3.3高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)能准确测高效的定性

15、定量测量复杂组分中黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量。宋卫尝试用HPLC法成功测定出双黄连含片中黄芩苷和汉黄芩素的含量；周静安成功的采用HPLC测定黄芩中药牙膏中的黄芩苷与丹皮酚的含量，均得到满意效果。为了评估黄芩提取物的质量，发展超高效液相色谱（UPLC）分析方法，从而能够同时测定草本提取物中多种目的成分便显得尤为重要。中草药植物黄芩中含有的主要的有效成分是黄芩苷和黄芩素，此外还有少量的汉黄芩苷和汉黄芩素等成分，四种黄酮类物质都有紫外吸收的特征结构大苯环，对黄芩苷和黄芩素的分析增加了干扰，因此需要寻找一种能够同时高效地把黄芩中可能含有的多种组分分离并鉴定出来的方法。超高效液相色谱法（UPLC）能根据

16、这四种组分的极性不同将其同时分离出来，因此本实验中采用UPLC法测定黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量。文献中曾报道过的同时分析黄芩中几种组分的方法有如下：温庆伟测量小柴胡汤配方颗粒中黄芩苷的含量中应用的超高效液相色谱，色谱条件为ACQQUTY UPLC C18 (2.1mm×100mm，1.7um)色谱柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(40:60)，流速0.31mL/min,检测波长315nm.出峰的效果非常好，而且无杂质峰的出现，黄芩苷的保留时间约为7.9min。李强为了测量黄芩药材中黄芩苷的含量采用超高效液相色谱，色谱条件SHIMADZU 超高效液相色谱仪Shim-pack XR-O

17、DS C18柱 ( 4.6mm × 150mm，2.2m) ; 流动相: 甲醇 水 冰醋酸( 45 55 1) ,流速: 0.6mL/min ; 检测波长: 274nm; 柱温:45; 进样量 3L;黄芩苷出峰的保留时间约为7min,黄芩素出峰的保留时间3.5min,效果非常显著性。李华等人分别用HPLC和UPLC测量黄芩中五种酮类成分的含量，并比较HPLC和UPLC两种方法的优缺点，HPLC的色谱条件 DiamonsiL C18(250mm×4.6mm,5um);流动相：流动相A为乙腈-水-甲酸（21：78：1）流动相B为乙腈-水-甲酸（80：20：1）梯度洗脱（010m

18、in.100% A;105min.100%90%A . 3570min.90%65%A;7085min,65%5%A;柱温：30，流速：1.0mL/min;检测波长：280nm.黄芩苷的保留时间为18min , 黄芩素的保留时间为55min,实验进程不是太理想，检测时间太长，耗费的原材料太多，使用UPLC时的色谱条件 Aquity BEH C18 （50mm×2.1mm ,1.7um）;流动相：0.1%甲酸水溶液A-乙腈B，梯度洗（00.5min.82%A;0.5-2.0min,82%80%A;2.06.0min 80%70%A;68min.70%A；810min 70%40% A;

19、1012min 40% A；柱温 40 ;流速 0.4mL/min;检测波长：280nm。黄芩苷的保留时间为3.0min,黄芩素的保留的时间6.0min。所以我们使用UPLC会使效率更高，精确度很高。刘金欣，孟繁蕴，张胜海，卢恒 ，周骁腾采用 UPLC 同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A的含量 色谱条件Waters accquity UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 m）；流动相：乙腈（B）-0.1%甲酸（A），梯度洗脱（09 min，11%19%B；910 min，19%23%B；1013 min，23%36%B；1315

20、min，36%90%B）；体积流量为0.6 mL/min；进样量为2 L；检测波长280 nm，黄芩苷的保留的时间为 5.0min，黄芩素的保留为10.0min,效果非常明显。梁研尝试用WatersC18（4.6×250 mm，5 um），以甲醇水磷酸（47:53:0.2）为流动相等梯度洗脱的方法，来测量黄芩中黄芩苷、黄芩素的含量，流速为0.61 mL/min，检测波长为280nm，柱温为24，得到比较好的分析效果，但是黄芩苷出峰的保留时间约为18min，黄芩素出峰的保留时间约为58min，分析时间非常长，耗费的原材料太多，所以还是不太理想。徐占飞等人综合了其他人的高效液相色谱（HP

21、LC）的方法，在此基础上改进了前人的研究方法，采用超高效液相色谱来测量双黄连胶囊中黄芩苷和黄芩素的含量时采用AgiLent EcLipse XDBC18柱（4.6×250 mm，5 um），以甲醇0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为277nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10µL，柱温为30，结果出乎意料，因为分析显示黄芩苷和黄芩素的分离度非常好，每一种物质峰分离的非常明显，黄芩苷出峰的保留时间为14min，黄芩素出峰的保留时间为24min； 李春红采用Dikma DiamonsiL C18柱（4.6×250 mm，5 um）测量栀子金花丸中黄芩苷

22、、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量时，以乙腈0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，梯度变化为0min20min50min，乙腈5%15%45%，变波长测定，柱温为30，流速为1.0 mL/min，进样量为10µL，结果显示黄芩中各组分分离度很好，特征峰明显，黄芩苷保留时间为7min，黄芩素保留时间为16min；测量效果不错李春改变了色谱柱采用Dikma DiamonsiL C18柱（4.6×250 mm，5 um）测量龙胆泻肝制剂中黄芩苷和汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量时，以乙腈0.05%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，梯度变化为0min10min20min，乙腈30%40%90%

23、，检测波长为278nm，柱温30，流速为1.0 mL/min,进样量为10µL，结果显示黄芩苷的出峰保留时间为7min，黄芩素的出峰的保留时间为16min，各峰之间分离很好，而且时间缩短了综上述考虑，最终决定采用刘金欣，孟繁蕴，张胜海，卢恒 ，用 UPLC 同时测定黄芩中黄芩苷、黄的含量时的方法，并在实践中按照实际需求和实际结果，将方法做出改进，把洗脱梯度变化修改为，流动相：乙腈 C ，磷酸 D ；00.68min ,30%C,70%D；0.681.02min,30%40% C,70% 60%D;1.021.36min ，40% 65% C，60% 35% D;1.362.30min

24、,30%C ,40%D的梯度洗脱，黄芩苷和黄芩素对照品溶液分析结果对比，得到的结果显示，出峰非常快，所用时间短，效率比较高，黄芩苷和黄芩素的分离度优良且与其他各峰之间分离良好，因此在之后的研究中采用此方法。2. 研究内容本文主要通过对黄芩的质量标准及其测定方法的研究，研究一种分析黄芩中黄芩苷和黄芩素含量的高效、快速、便捷的超高效液相色谱（UPLC）方法，用于实际生产中黄芩原料药的质量控制。3. 研究意义我国畜牧业的生产发展一直受抗生素类等药物残留制约，我们在不断寻找有效的方法来控制动物体内的药物残留。因此，我国科研人员一直不断努力寻找那种无残留且高效的绿色饲料添加剂，也是他们艰苦奋斗目标。黄芩

25、苷因具有较好的抗氧化提高免疫等功能，对动物体内产生的耐药性很小，在我国畜牧生产实践中已得到验证，并且应用非常广泛。但是目前黄芩苷在畜禽生产中还主要是以复合制剂形式添加到饲料中为主或以药物注射添加为辅。3.1禽类李振旧采用含有黄芩植物药材喂养白羽鸡蛋鸡取得了非常好的效果，并且在夏天的时候，他还做了饲喂蛋鸡添加黄芩植物药，这些实验研究表明黄芩可以明显的提升蛋鸡的白蛋白质量浓度，还可以降低血清中乳酸脱氢酶，升高碱性磷酸酶的活性。为了研究黄芩提取物是否能治疗和防治蛋鸡大肠杆菌、白痢，梁英选取的实验动物为作为实验研究材料，实验数据表明刚刚出生的蛋鸡存活率非常高，而且发病率明显降低，并且蛋鸡的器官病理变化

26、有明显的降低趋势，发病的治愈率都比其他的实验组高很多，此次实验证明了黄芩提取物可以提高蛋鸡的抗病机制，一定程度上抑制了蛋鸡体内的细菌。梁英等人为更好的探究黄芩提取物对鸡生长性能和肠道微生物的影响，在肉仔鸡饲粮中加入一定量的黄芩提取物，每天饲喂，比较肉仔鸡的生长性能以及微生物的数量，经过 一段时间的喂养，每一只肉仔鸡体内的大肠杆菌、沙门氏细菌菌群的数量明显的降低，令人惊讶的是乳酸菌菌群的数量出现显著性的增加，实验研究表明饲粮中添加适量黄芩中草药可以一定程度上促进肉仔鸡显著性生长，一定程度上改善畜禽生物菌群的生长速度，最后实验结果显示在肉仔鸡的基础日粮中添加 10mg/kg黄芩提取物，鸡的生产性能

27、最明显。3.2 猪 为了研究黄芩提取物对断奶仔猪的生产性能的影响，李国忠等人选取了一定数量的断奶仔猪，在断奶仔猪的的日粮中加入一定梯度的黄芩提取物，经过一定时间的饲养，可以明显的观察到加入黄芩提取物的实验组的断奶仔猪食欲加强，断奶仔猪的采食率明显升高，而且断奶仔猪的腹泻率明显降低，一定程度上降低了饲料的成本，提高了饲料报酬，从实验数据来看在饲料中添加15%的黄芩提取物，断奶仔猪的生产性能是最好的，采食量比没有添加黄芩提取物的对照组断奶仔猪提高了12.9%，饲料的料重比明显的降低了15.0%。所以黄芩提取物对断奶仔猪的生产性能有非常大的影响。 徐中进一步研究了黄芩提取物对生长猪的生产性能的影响，

28、在李国忠的实验基础上选取了大小相同、体重相近的日龄在45天的三元杂交的生长猪进行实验，将实验组的猪随机的分为两组，一组添加黄芩提取物，另外一组不添加黄芩提取物，结果数据显示添加黄芩提取物的实验生长猪的生产性能明显提高，为了探究生长猪最适宜的黄芩提取物的浓度，徐中继续配置了一系列梯度的浓度的黄芩提取物的饲料日粮，饲喂一段时间后发现，实验组猪饲料中添加0.20%的黄芩提取物的生长猪平均日增重比其他实验组的生长猪生产性能明显提高了829，添加的饲料的料重比明显降低了496，差异性非常显著。3.3 反刍动物火晓东阅读文献发现黄芩提取物对家禽、猪的生产性能都有一定的影响，而且在一定的浓度内，是有明显的升

29、高的趋势，为了确定黄芩提取物对反刍动物生产性能有促进影响，研究人员设置两个实验组，一组添加一定量的黄芩提取物，另外一组作为空白实验组，研究发现黄芩提取物能促进反刍动物的生产性能提高。为了探究反刍动物的最适宜的黄芩提取物的浓度，徐中继续配置了一系列梯度的浓度的黄芩提取物的饲料日粮，饲喂一段时间后发现，意外发现黄芩提取液可以一定程度上降低应急牛奶，牛奶的奶乳与对照组没有明显的差异因此说明奶牛饲粮中添加含黄芩的中草药，可以一定程度上有效的缓解热应激对产奶奶牛的不良影响，且不会影响牛奶品质。第二章 实验研究1. 材料方法1.1 实验材料实验仪器：Waters超高效液相色谱系统（二元脱气泵，PDA检测器

30、，1525型泵，033381型自动进样器，MiLLennium32化学工作站）（美国Waters公司）； BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）（上海）SH72000型予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限公司）RE52型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）DHG9141A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）D2G6020真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）DF101S智能集热式恒温磁力搅拌器（武汉德力祥仪器设备有限公司）SH7-2000 循环抽水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)KQ5200型 超声波清洗机（昆山市超声波仪器有限

31、公司）1000uL移液枪 （大龙实验仪器北京有限公司）有机针筒过滤器 Ø13mm 孔径 0.22um (上海兴亚净化材料厂)试验试剂：黄芩饮片（天马中药饮片科技公司）(安徽);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司); 黄芩素标准品 （中国食品药品检定所）（含量为97%）;甲醇（色谱纯）（天津市科密欧化学试剂有限公司）； 乙腈（色谱纯）（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸（武汉市江北化学试剂有限责任公司）1.2 实验方法1.2.1 色谱条件色谱柱为water 公司ACQUITY UPLC®BEH C18 1.7um (2.1×50mm coLumn Made in

32、IreLand)，流动相为乙腈0.05%磷酸，流速为0.61mL/min，柱温30，紫外检测波长为278nm，进样量为0.4µL。流动相用抽水式真空泵微孔过滤（乙腈用聚偏氟乙烯树脂滤膜过滤，磷酸用无机滤膜过滤），然后置于超声波清洗机中超声脱气20分钟。表1 梯度洗脱条件序号时间(min)流速（mL/min)%C（乙腈）%D（0.05%磷酸）1初始0.61307020.680.61406031.020.61653541.360.61307052.300.6130701.2.2标准溶液配制分别精密称取黄芩苷对照品(含量以93.3%) 0.0080g、黄芩素对照品97.8%,置于五氧化二磷

33、减压干燥中干燥12小时以上使用) 0.0040g加适量甲醇，超声15min后,带其冷却，定容至50mL的容量瓶中,配置成浓度为160ug/mL的对照品黄芩苷母液、浓度为80ug/mL的对照品黄芩素母液，待用。1.2.3黄芩苷和黄芩素原料药溶液的提取的制备用称取分析天平称取14倍的药材剂量黄芩饮片60g，用一次性塑料袋密封装袋待用，装入三口瓶中，加入50%的水和50%的乙醇混合液820mL ,缓慢加入三口瓶中，瓶口用塞子封住，防止乙醇挥发，浸泡30min，加入磁力搅拌转子，加上温度计,接上回流冷凝管，打开水龙头，在磁力旋转蒸发器中蒸馏175min ，温度设置373K，取提取液5管，每管5mL置于

34、04冰箱中待用。1.2.4 黄芩苷、黄芩素样品混合液的配置取1.2.3原料提取液1mL于100mL的容量瓶中，加适量的甲醇，超声15min,加甲醇至刻度线,置于04的冷藏箱中待用。2方法学验证2.1 专属性考察精密吸取1.2.2中黄芩苷、黄芩素浓度为96µg /m L、48µg /m L的对照品溶液 、黄芩提取液混合液待用，记录色谱图（图2）。由图可知，在此UPLC方法下，黄芩提取液中的黄芩苷和黄芩素能够达到充分分离，分离度很好，对比样品色谱图与标准品色谱图，证明tR =0.6min出峰物质为黄芩苷，tR=1.2min的出峰物质黄芩素。 图2 黄芩苷对照品 图3 黄芩素对照

35、品 图4 黄芩提取液样品2.2 标准曲线及线性关系考察精密吸取1.2.2黄芩苷、黄芩素对照品溶液1、2、5、10、15mL，分别用进口甲醇定容至25mL的容量瓶中配置成黄芩苷的浓度为6.4 、12.8 、32 、64 、 96ug/mL,黄芩素的浓度为3.2、6.4、16、32、48ug/mL的对照品溶液，每次进液0.4uL,进样6次，在上述色谱条件下，测定色谱峰面积，分别以黄芩苷、黄芩素对照品的浓度为横坐标X，峰面积Y为纵坐标得到线性回归方程，得到黄芩苷回归方程 y=2220.7x-270.32，R=0.999,得到的黄芩苷线性范围6.4ug/mL96ug/mL得到其黄芩素的回归方程y=36

36、96.6x-279.56,R=0.9991,得到其黄芩素的线性范围3.2ug/mL48ug/mL。图 5 黄芩素的标准曲线图6 黄芩苷的标准曲线2.3精密度试验精密吸取1.2.2黄芩苷、黄芩素标准对照品溶液5mL置于25mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，用0.22um的进口过滤膜过滤，每次进样0.4uL，进样9次，精密吸取1.2.3.1黄芩苷、黄芩素提取液混合液5mL置于25mL的容量瓶中，定容至刻度，用0.2uL的进口过滤膜过滤，每次进样0.4uL，进样9次，得到黄芩苷、黄芩素标准对照品的峰面积的积分值RSD=1.30%、RSD=1.4%，说明仪器的精密度良好。 表2 精密度实验（n=9)序号

37、黄芩苷峰面积黄芩素峰面积168187558332700785764536993857112468525570695703855678966921456656768426584638679485815596900957426均值69078.8957238.67 RSD%1.301.402.4稳定性试验精密吸取1.2.3.1中黄芩提取液溶液0.4µL，按上述色谱条件，在配制完成后的0、1、2、4、8、16、24h内各测定一次含量，每个时间间隔内连续进样3针，进行测定黄芩苷、黄芩素的峰的面积的测量，有下表可知黄芩苷的RSD=0.30%,黄芩素的RSD=1.20%，故黄芩苷、黄芩素的混合提取

38、液在24小时内稳定性良好。表3 稳定性实验时间（小时）峰面积平均值降解量（%）黄芩苷黄芩素黄芩苷黄芩素012511940508001125089400590.021.122125103398740.011.614124857398430.211.648124978389990.103.7216124567395320.442.4124124148394730.802.562.5重复性试验精密吸取1.2.3黄芩苷、黄芩素提取液混合液5mL置于25mL的容量瓶中，定容至刻度，用0.2uL的进口过滤膜过滤，每次进样0.4uL，进样6次，得到黄芩苷、黄芩素的提取液混合液的峰面积的积分值 RSD=0.6

39、2%、RSD=0.77%，说明本方法重复性良好。表4 重复性试验（n=6）序号黄芩苷峰面积黄芩素峰面积127188982080227667785195327331685611427344081955527713185972627393882349均值275366.8983508.78RSD%0.791.902.6加标回收率的测定取已知含量黄芩苷、黄芩素的1.2.4提取液混合液1mL于25mL容量瓶中，按照提取液中黄芩苷的含量的 80%、100%、120%加入黄芩标准品溶液（含量为93.3%），用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。每个水平配置3个平行样品。取已知含量黄芩苷、黄芩素的1.2.4提取

40、液混合液1mL于25mL容量瓶中，按照提取液中黄芩素的含量的 80%、100%、120%加入（含量为97.8%），用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。每个水平配置3个平行样品。测定前需配置相同试样浓度的黄芩苷、黄芩素试样浓度，加标试样浓度，加标量试样浓度，每次进样0.4uL,进样三次取平均数。3黄芩的提取液含量测定 按照1.2.4的方法配制三批不同的黄芩原料药溶液，并精密吸取样品溶液20µL，每个样品各进3针，进样量为0.4uL,在上述色谱条件下进行分析，记录色谱图，积分求得黄芩苷和黄芩素的峰面积值，按照外标法求得各样品中黄芩苷和黄芩素的含量。结果如下表（表4）所示。表5 不同批次黄

41、芩中黄芩苷和黄芩素的含量批次黄芩苷峰面积黄芩苷含量mg/g黄芩素峰面积黄芩素含量mg/g第一批12510356.53953210.8第二批12414856.03947310.7第三批12485756.34050811.04 讨论本试验采用 超高效液相色谱（UPLC测定黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量，经对流动相组成、比例，以及柱温、流速、检测波长等进行色谱条件的优化，我们先后尝试了流动相：乙腈（B）-0.1% 磷酸（A），梯度洗脱（09 min，11%19%B；910 min，19%23%B；1013 min，23%36%B；1315min，36%90%B）；这种洗脱的效果不是太佳，而且比较浪费原料

42、，故比较好的测定样的色谱条件为流动相；为乙腈（流动相 C），0.05% 磷酸（流动 D ）；00.68min ,30%C,70%D；0.681.02min,30%40% C,70% 60%D;1.021.36min ，40% 65% C，60% 35% D;1.362.30min,30%C ,70%D的梯度洗脱。我们试用过320nm波长条件，紫外吸收效果不佳，最终我们确定为流速为0.61mL/min，柱温30，紫外检测波长为278nm，进样量为0.4 µL。在此色谱条件下，黄芩中黄芩苷、黄芩素与杂质峰完全分离，且峰型对称无拖尾。另外，在此条件下黄芩苷在6.496µg/mL范

43、围内，黄芩素在3.248µg/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.999和0.9998。结果表明，采用UPLC法测定黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量快速、简便、灵敏度高，为黄芩提取物中黄芩苷和黄芩素的同时测定提供了方法。在实验的过程由于黄芩提取物中黄芩苷、黄芩素的浓度是未知，为了更好地确定提取物的浓度我分别作了多次实验，第一组从提取液中用移液枪吸取了1000uL的提取液，加入100mL的容量瓶，用超高效液相（UPLC）测出峰的面积。第二组的是从提取液中吸取2mL的提取液溶解在100m的容量瓶中，加甲醇稀释，测出两组峰的面积相差一部左右，为了使样品的峰的面积恰好处于标准曲线的适用范围，实

44、验期间配制了非常高的浓度的黄芩苷、黄芩素的标准品，最后发现从黄芩提取液中吸取1mL的溶液，稀释100倍后过滤进样是比较合理的。由于超高效液相色谱对实验样品的要求非常高，所以在每次测样的时候我们都需要进行不断的进行过滤，有时过滤的过滤器会出现质量问题，所以每次过滤完毕的之后，我们需要检查溶液是否过滤干净，防止在样品检测的时候将柱子堵塞。我们使用的水必须是试验中采用电阻率为18.25的超纯水，且对流动相的品质要求高，并要求进行严格的过滤及超声处理，否则极易导致柱压升高，柱子堵塞，甲醇的浓度必要高。5 试验方法的优缺点5.1 缺点1）由于原料药的浓度是不确定的，所以在配置的提取样的时候，浓度具有不确

45、定因素的，需要配置多个浓度梯度来选择符合要求的浓度样品浓度，有时会因为每批次的样品不一样导致提取液浓度不一样，为了更好的进行样品含量的检测，我们需要进行不同批次的含量检测。2）由于提取物的样品成分含量比较复杂，而且仪器对样品要求比较高，我们需要进行多次过滤，当仪器压力偏高的时候，应立即停止测量，进行仪器的保养工作。3）未进行加样回收率试验。由于做加样回收率实验导致仪器的压力偏高，仪器出现报警，为了防止柱子被堵，只好放弃本次的实验操作。5.2 优点本文研究的方法，能够快速、简便、高效的分析黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量，且主峰与杂质峰分离度很好，峰型对称，无拖尾峰，基线平稳。虽然存在标准溶液浓度范围

46、偏小的问题，但是在后续的试验以及实际应用中仍然有很高的参考价值。1) 小颗粒、高性能微粒固定相同时出现。5um的UPLC色谱柱填充料为十八烷基硅胶键合柱，但是我们用的是1.7um BEH 十八烷基硅胶键合柱。这样的孔径更加利于物质分离2) 采样速度非常快，且采用二极管阵列检测器，可以得到3d光谱图，更利于复杂物质分离检测的定性判断3) 自动进样技术水平非常高，每次进样之后系统都会进行洗针操作，因此可以达到低扩散减少了交叉污染。系统还配备了压力辅助系统，可以更好的观察到系统的压力，针上还装备了进样探头，可以精确快速的采样。4) 仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了Waters公司的 E-pow

47、ers-3的系统，以及搭载了多种软件平台，实现了更加准确定性分析，减小系统带来误差。 5) 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度都比HPLC高很多，我们使用UPLC检测黄芩苷用了0.6min,检测黄芩素1.2min，在同等条件下使用HPLC测量黄芩苷需要5.7min,而黄芩素素需要13.4min左右才能出峰，所以它缩短了分析时间，同时减少了流动相溶剂用量降低了分析成本。参考文献1陈立柱、赵怀清HPLC法同时测定消炎片中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量.沈阳医科大学学报. 2011.6.28（6）2丁瑞.HPLC法测定清解合剂中黄芩苷的含量.海峡药学J，2013，25（2）3胡世强、张伟、张永耀 RRLC法同时测定蒲地蓝消炎胶囊中绿原酸、野黄芩苷、黄芩苷混合黄芩素的含量 中药新药与临床药理 2013.24.4 （7）21何秀琼、裴利霞、王一涛、郑颖 高效液相色谱法研究大鼠灌胃黄芩素的药动学 中国医院药学杂志 2010.30.223梁妍、石任兵、梁吉春HPLC法测定黄芩中黄酮中3种成分的含量. 北京中医药大学学报. 2009.32（4）4李春红、梅志强、何兵、田吉HPLC同时测定龙胆泻肝制剂中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量. 生物学通报.2012.47 (4)5李晓明、罗