第八章 细胞凋亡

1、整理课件1l概述概述l细胞凋亡过程与机制细胞凋亡过程与机制l细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病l细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 第八章第八章 细胞凋亡细胞凋亡整理课件2 概述概述整理课件3坏死凋亡整理课件4apoptosis整理课件5整理课件6细胞坏死与细胞凋亡的区别细胞坏死与细胞凋亡的区别整理课件7 细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别特征特征 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死诱导因素诱导因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 强烈刺激强烈刺激受累范围受累范围 单个细胞丢失单个细胞丢失 成群细胞死亡成群细胞死亡膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即丧失早期即丧失细胞体积细胞体积 减小、

2、固缩减小、固缩 增大肿胀增大肿胀染色质染色质 凝聚成半月形凝聚成半月形 稀疏成网状稀疏成网状细胞器细胞器 无明显变化无明显变化 肿张破坏肿张破坏溶酶体溶酶体 保持完整保持完整 破坏外溢破坏外溢细胞形状细胞形状 形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂成碎片破裂成碎片基因组基因组DNA DNA 有控降解有控降解 随机降解随机降解大分子合成大分子合成 一般需要一般需要 不需要不需要基因调控基因调控 有有 无无后果后果 不引起炎症反应不引起炎症反应 引起炎症反应引起炎症反应意义意义 生理死亡方式生理死亡方式 病理死亡方式病理死亡方式整理课件8 凋亡过多或不足疾病： 肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤整理

3、课件9 二二 、凋亡时细胞的主要变化、凋亡时细胞的主要变化1. 形态学改变形态学改变 （The morphologic characteristics of apoptosis）整理课件10细细 胞胞 凋凋 亡亡整理课件11(扫描电镜)正常细胞正常细胞(扫描电镜) (透射电镜) 凋亡细胞凋亡细胞凋亡小体凋亡小体整理课件12DNA片断化caspase激活灭活凋亡抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白Ca 2+ /Mg 2+ Zn 2+ 核酸内切酶激活核酸内切酶激活2. 生化改变生化改变（The biochemical characteristics of apoptosis）整理课件13整理课件14整理

4、课件15凋亡诱导因素凋亡诱导因素 死亡信号死亡信号凋亡相关基因激活凋亡相关基因激活 凋亡的执行凋亡的执行 凋亡细胞清除凋亡细胞清除 整理课件16凋亡的机制凋亡的机制整理课件17细胞凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径细胞凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径整理课件18l死亡受体（死亡受体（death receptor, DR） 肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋白，与相应配体结合传递细胞信号 Fas(CD95), TNFR1, RAIL-R2/DR5整理课件19 参与死亡受体信号转导的接头蛋白： 死亡结构域蛋白死亡结构域蛋白（ death domain protein, DD）lTRA

5、DD：TNF受体相关死亡结构域蛋白 TNF + TNFR1（死亡结构域）+ TRADD 细胞凋亡lFADD：Fas相关死亡结构域蛋白 FasL + Fas （死亡结构域） +FADD 细胞凋亡 整理课件20FasL + Fas 凋亡诱导复合物（DISC） FADD（C端DD结构域与Fas胞内段结合 N端DED结构域与无活性caspase8酶原交联）l caspase8酶原聚集到复合物上l 一系列caspase激活l 细胞凋亡 整理课件21FSALFas整理课件22整理课件23l线粒体释放细胞色素C 细胞凋亡 PT孔开放线粒体跨膜电位，细胞色素C释放 促凋亡蛋白Bax促PT孔开放 抗凋亡蛋白Bc

6、l-2、Bcl-xl抑制PT孔开放整理课件24l细胞色素C + Apaf-1 + caspase9前体凋亡体凋亡体 召集并激活caspase3 细胞凋亡 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子整理课件25线粒体途径线粒体途径+caspase-independent apoptosisBid整理课件26lCaspase特点： -以酶原的形式存在 -酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性 -水解天冬氨酸C端肽键 故称 Caspases (Cysteine，aspartic acid，protease) 整理课件27Caspase家族的分类l凋亡启动亚类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶蛋白酶： Caspase8

7、， Caspase 9，Caspase10l凋亡效应亚类凋亡效应亚类Caspase蛋白酶蛋白酶： Caspase3， Caspase6， Caspase7lICE(interlukin-1converting enzyme)亚类Caspase蛋白酶：参与炎症反应 Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11, Caspase12， Caspase13， Caspase14整理课件28大小亚基结合（二聚体） caspase活（四聚体） Pro-caspase： NH2末端结构域 、20KD亚基、 10KD亚基 剪切整理课件29整理课件30lCaspaseCaspa

8、se可激活可激活CADCAD (caspase-activated DNase)核酸酶核酸酶，该酶在核小体的连接区将DNA切断，形成约200bp整倍数的核酸片段l正常情况下， CAD与抑制物ICAD-DFF-45结合，存在于胞质中，无活性lCaspase活化后降解抑制物ICAD， CAD激活并入核降解DNA使其片段化整理课件31整理课件32整理课件33Caspase-independent apoptosis） 整理课件34细胞凋亡细胞凋亡整理课件35l凋亡相关因素凋亡相关因素l凋亡信号的转导凋亡信号的转导l凋亡相关基因凋亡相关基因整理课件36整理课件372、凋亡信号转导的特点、凋亡信号转导的

9、特点多样性：多样性：不同种类细胞有不同的信号转导系统不同种类细胞有不同的信号转导系统偶联性：偶联性：死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程 中的信号转导系统在一些环节上交叉、偶联中的信号转导系统在一些环节上交叉、偶联同一性：同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系 统引起细胞凋亡统引起细胞凋亡多途性：多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触 发细胞凋亡发细胞凋亡整理课件38整理课件39 Bcl-2Bcl-2基因基因 （B cell lymphoma/leukemia-2B cell

10、 lymphoma/leukemia-2）l广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞 Bcl-2家族已发现15个成员，可分为3个亚族： Bcl-2Bcl-2亚家族亚家族：抑制细胞凋亡 BaxBax亚家族：亚家族：促进细胞凋亡 BH3BH3亚家族：亚家族：促进细胞凋亡整理课件40整理课件41Bcl-2Bcl-2抑制凋亡机制：抑制凋亡机制：维持细胞钙稳态整理课件42 促进增殖lc-myc(转录调节因子) 诱导凋亡 Bcl-XL 抑制凋亡lBcl-x Bcl-Xs 促进凋亡GF整理课件43 p53促凋亡机制：促凋亡机制：整理课件44C-mycC-myc双向调控凋亡双向调控凋亡 调

11、控细胞周期基因，编码的蛋白是调控细胞周期基因，编码的蛋白是DNADNA结合蛋白，结合蛋白，调控基因转录。调控基因转录。 GFGF充足时主要激活介导细胞增殖的基因充足时主要激活介导细胞增殖的基因 GFGF不足时激活凋亡基因不足时激活凋亡基因 整理课件45整理课件46整理课件47整理课件48整理课件49整理课件50整理课件51细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡在疾病防治中的意义 合理利用凋亡相关因素合理利用凋亡相关因素1.1.诱导靶细胞凋亡诱导靶细胞凋亡 放疗、化疗放疗、化疗 高热、高温高热、高温2.2.减少细胞凋亡减少细胞凋亡 ： NGFNGF、促生长因子、抗氧化剂、促生长因子、抗氧化剂抑制抑制

12、Bcl-2Bcl-2抗凋亡作用抗凋亡作用促进促凋亡基因作用促进促凋亡基因作用增强增强P53P53促凋亡作用促凋亡作用整理课件52 干预凋亡信号转导干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制控制凋亡相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降整理课件53 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 1、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测 2 2、磷脂酰丝氨酸外翻分析（、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 3 3、线粒体膜势能（、线粒体膜势能（mtmt）的检测）的检测 4 4、DNADNA片断化检测片

13、断化检测 5 5、TUNELTUNEL法法 6 6、Caspase-3Caspase-3活性的检测活性的检测 7 7、凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白TFAR19TFAR19的表达和细胞定位分析的表达和细胞定位分析 整理课件541、细胞凋亡的形态学检测、细胞凋亡的形态学检测 光学显微镜和倒置显微镜光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细

14、胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。 电子显微镜观察电子显微镜观察整理课件55Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）整理课件56 电镜观察电镜观察 凋亡细胞体积变小，胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多空泡结构。IIa染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 整理课件57 流式细胞术检测：流式细胞术检测：整理课件582 2、磷脂酰丝氨酸外翻分析（磷脂酰

15、丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） Phosphatidylserine(PS) Phosphatidylserine(PS) 正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面 Annexin-VAnnexin-V： Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）标记后作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。整理课件592、磷脂酰丝氨酸外翻分析（、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法）整理课件60整理课件61整理课件62整理课件63Apoptoti

16、c HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI整理课件643、线粒体膜势能（线粒体膜势能（mtmt）的检测）的检测 线粒体荧光染料线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。整理课件654 4、DNADNA片段化分析片段化分析 细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。整理课件665、TUNEL法法整理课件67整理课件68整理课件696 6、CaspaseCaspase活性检测活性检测整理课件70整理课件717 7、