生化实验报告肝糖原测定.doc

1、生化实验报告肝糖原测定生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：_实验教学中心第一部分一、实验目的掌握程度 实验主要目的1.掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法2.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器3.熟练运用溶液混匀的各种方法（试情况而定，采用合适的混匀方法）4.正确掌握溶液转移的操作5、正确操作使用分光光度记 二、实验原理掌握程度 实验内容及原理 实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验时间_实验地点_指导老师赵_组员_评分批改日期肝糖原的提取与鉴定糖原储存在细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织

2、中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶乙醇而溶于热水，故先用 95的乙醇将滤液中的糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈现乳样光泽，遇碘变红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判断肝组织中糖原的存在。CuSO 4 +2NaOH=Na 2 SO 4 +Cu(OH) 2 2Cu(OH) 2 +C 6 H 12 O 6 =2 CuOH+氧化型葡萄糖+H 2 O 2 CuOH= Cu 2 O (红色)+ H 2 O Cu(OH) 2 = CuO（黑

3、色）+ H 2 O肝糖 原定量测定糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在 10100ug,溶液颜色的深浅可与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，可得到样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。一、材料与方法1、实验材料 样品鸡肝试剂肝糖原的提取与鉴定：95乙醇，0.31mol/L(5)三氯醋酸溶液，浓盐酸，NaOH 溶液，碘试剂,班氏试剂。肝糖原定量测定：30

4、KOH 溶液，0.5mg/ml 的葡萄糖溶液，蒸馏水，蒽酮显色剂。仪器和器材可见光分光光度计，恒温水浴箱，试管架，三支试管，加样枪，加样枪架，普通离心机，研钵，刻度吸量管，白瓷反应器，100ml 容量瓶。2、实验流程 肝糖原的提取与鉴定：鸡肝约 1.5 g，剪碎 5CCl 3 COOH 1 ml 研磨至乳状 5CCl 3 COOH 3 ml 研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心 3 分钟（4000 r / min）沉淀（弃去）上清（取 3 ml）3ml 95乙醇，混匀，静置 10 分钟 离心 5 分钟（4000 r / min）上清（弃去）沉淀 蒸镏水 1 ml 沸水浴 2 分钟，溶解沉淀白瓷板

5、孔穴中糖原溶液 1ml 浓 HCl 5 滴 加碘试剂 2 滴加碘试剂 2 滴沸水浴 15 分钟，冷却 糖原溶液 2 滴50NaOH 5 滴呈色对比糖原水解液 2 滴糖原水解液 班氏试剂 4 滴 混匀沸水浴 2 分钟，观察变化肝糖原定量测定鸡肝 0.15 g 30KOH 1.5ml沸水浴 15 分钟冷却，全部转入 100 ml 容量瓶中加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液糖原的测定取 3 支试管，按下表操作。试剂（ml）空白管 标准管 样品管 蒸馏水 1.0 标准葡萄糖溶液 1.0 糖原提取液 1.0 0.2蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5 混匀，沸水浴 10 分钟，冷却c 。在分光光度计 62

6、0 nm 波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。4、注意事项 肝糖原的提取与鉴定 在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混匀，可以用玻璃棒搅拌。糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基的多少有关。肝糖原分支中葡萄糖残基在 20 个以下，吸附碘后呈现红棕色。肝 糖 原 定 量测定肝组织必须在沸水浴中完全溶解，否则影响比色； 注意要收集全部溶液，用水多次洗试管，一并收入容量瓶中； 加入蒽酮溶液时要小心操作，将试管放在试管架上进行； 如果溶液呈浑浊，则因配制蒽酮溶液的硫酸浓度不够所致。第二部分一、实验结果与处理1、实验现象 操作过程 现象图片 （1 1 ）鸡肝在三氯醋酸中

7、，被研磨成肝匀浆(2) 鸡肝研磨成肝匀浆后转入试管（3 3 ）第一次离心后（4 4 ）第一次离心后上清液转移到另一试管（5 5 ）第二次离心后（6 6 ）第二次离心后的沉淀（7 7 ）沸水浴使沉淀溶解后（8 8 ）糖原水解液（9 9 ）班氏试剂与糖原水解液反应：溶液显蓝色，砖红色不明显（ 10 ）白瓷板孔穴中糖原与碘反应（左边为碘试剂与肝糖原溶液，右边为碘试剂）: :紫色不明显（ 11与 ）鸡肝与 30 的H NaOH 溶液混合在沸水浴中加热后: :呈血红色（ 12 ）糖原溶液装入L 100mL 容量瓶混匀后：刻度线处有些许气泡，混匀过程造成（ 13 ）糖原提取后的测定，三支试管水浴后（1 1

8、 、2 2 、3 3 号试管分别为空白管、标准管、样品管）：三只试管水浴 10min后，标准管颜色最为明显，为绿色，加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。2、实验数据记录 在分光光度计 620nm 波长处，测定各管溶液的分光度（A），记录结果如下：各管吸光值 测定次数空白标准样品 10.0000.3500.01020.0000.3510.01130.0000.3530.0133、实验结果 肝糖原的提取与鉴定：显色反应中，碘液由黄色变为红棕色（不明显），说明所提供材料中含糖原成分，但含量低；加入班氏试剂的溶液无明显的颜色变化；肝糖原定量测定（1）鸡肝所取质量：0.15g （2）各管

9、吸光值各管吸光值 测定次数空白标准样品 10.0000.3500.01020.0000.3510.01130.0000.3530.013平均值0.0000.3510.011标准管吸光度平均值 0.351； 样品管平均吸光度 0.011；由公式计算：11 .1 _1000100_g100_05 .0 _100 / g）肝组织重（ 标准样品肝组织）肝糖原（AAg =注：1.11 为此法测得的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，因为用蒽酮试剂显色时，110ug 糖原与 100ug 葡萄糖显色程度相当。故经计算最后结果为 0.116(g/100 肝组织)。4、讨论与分析p （1）与碘试剂反应时：加入糖原的

10、孔穴并没有出现明显的红棕色。可能原因如下：A、是在取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少； B、碘试剂本身是黄色的，本来现象就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。（2）糖原中葡萄糖的鉴定：实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。原因如下：A、沸水浴过程水温没有达到 100 摄氏度，且期间多个小组先后放、取水浴箱中的试管，对反应造成一定影响； B、糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到明显的砖红色。（3）在肝糖原定量测定中，由资料可知饱食鸡肝的肝糖原含量为：23g/100g 肝组织。而我们的结果明显偏低，实验中没有出现操作上的失误，讨论分析p 原因如下：A、所用鸡肝来并非饱食鸡的肝，且鸡肝