实验1_大肠杆菌的培养和分离2013-9-11emma

1、定义定义: :结构简单、形体微小的结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有单细胞、多细胞或没有细胞结构细胞结构的低等生物，包括的低等生物，包括病毒、原核生物病毒、原核生物( (细菌、细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体) )、原生生物、原生生物( (最简最简单的真核生物单的真核生物) )和某些真菌和某些真菌（酵母菌、霉菌）。（酵母菌、霉菌）。 微生物微生物显微镜显微镜功能功能（1 1）放线菌和霉菌中提取抗生素）放线菌和霉菌中提取抗生素 （2 2）酵母菌发酵酿酒）酵母菌发酵酿酒 （3 3）乳酸菌发酵制作泡菜）乳酸菌发酵制作泡菜 （4 4）醋酸菌发酵制作醋）醋酸菌发酵

2、制作醋 （5 5）红曲霉和毛霉发酵制作腐乳）红曲霉和毛霉发酵制作腐乳 （6 6）微生物用于治理环境）微生物用于治理环境细菌：细菌：是单细胞的原核生物。是单细胞的原核生物。结构组成：结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核分裂方式：分裂方式：二分裂（产生子细胞）二分裂（产生子细胞）菌落菌落( (子细胞群体子细胞群体) )单单菌落：菌落：由由单个细菌单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养（或其他微生物）在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼肉眼可见有可见有一定形态结构等特征的一定形态结构等特征的子细胞

3、的群落子细胞的群落。 不同微生物形成的菌落具有不同的特征（形态、突起、不同微生物形成的菌落具有不同的特征（形态、突起、边缘），边缘），是鉴定菌种的重要依据是鉴定菌种的重要依据。酵母菌酵母菌放线菌放线菌 霉菌霉菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（E.coli）分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、 污水、土壤、谷类、乳制品等当中。污水、土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的大肠杆菌在人体的_中一般对人体无害，但任何中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入大肠杆菌如果进入_都会对人体产生危害。都会对人体产生危害。大肠杆菌是大肠杆菌是_工程中被广泛采用的

4、工具。工程中被广泛采用的工具。肠道肠道泌尿系统泌尿系统基因基因革兰氏革兰氏_（填阴或阳）性菌（填阴或阳）性菌阴阴代谢类型：代谢类型：异养，兼性厌氧型异养，兼性厌氧型生长适宜温度：生长适宜温度：质粒、质粒、EcoREcoR限制酶、限制酶、 E.coliE.coli-DNA-DNA连接酶、连接酶、 受体细胞受体细胞3737左右左右实验一实验一大肠杆菌的培养和分离1.进行大肠杆菌的进行大肠杆菌的扩增扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进行细进行细菌培养的操作菌培养的操作2.进行大肠杆菌的进行大肠杆菌的分离分离,用用固体平板培养基固体平板培养基进行细进行细菌的划线培养菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的

5、条件和操作要求的原理说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理实验目的实验目的LBLB液体（固体）培养基液体（固体）培养基一、配制培养基一、配制培养基培养基：培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。繁殖使用的混合营养液。水、碳源、氮源、无机盐、生长因子水、碳源、氮源、无机盐、生长因子( (生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物化合物, ,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) )1、成分、成分区别于动物培养与植物培养：区别于动物培养与植物培养：不加激素不加激

6、素固体培养基与液体培养基的区别：固体培养基与液体培养基的区别：琼脂琼脂成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，AA，碱基等如如NaCl一、配制培养基一、配制培养基不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方实例：实例： “ “细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素” 细菌培养基细菌培养基要用要用蛋白胨和酵母提取物蛋白胨和酵母提取物来配制，还要来配制，还要加入一定的加入一定的氯化钠氯化钠，以维持一定的，以维持一定的渗透压渗透压；

7、霉菌培养基霉菌培养基一般用一般用无机物无机物配制或配制或添加蔗糖的豆芽汁添加蔗糖的豆芽汁调节调节pHpH真菌：真菌：5 56 6 细菌：细菌：6.5 6.5 7.5 7.5 溶解溶解计算称量计算称量调调pHpH分装分装加塞，包扎加塞，包扎灭菌灭菌2、过程、过程勿沾到瓶口或者壁上，易污染，则作废勿沾到瓶口或者壁上，易污染，则作废二、包器材二、包器材封口膜通空封口膜通空气不通细菌气不通细菌牛皮纸或报纸牛皮纸或报纸加盖后几个包在一起加盖后几个包在一起接种环接种环包牛皮包牛皮纸纸P20分装：分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管

8、中时必须用将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用_。加塞加塞：试管用塑料盖或：试管用塑料盖或_；三角瓶口用；三角瓶口用_ _ 或或_封口封口, ,再用再用_或报纸封口。或报纸封口。包扎：包扎：用用_或报纸或报纸三角漏斗三角漏斗棉花塞棉花塞封口膜封口膜6 6层纱布层纱布牛皮纸牛皮纸牛皮纸牛皮纸250ml装装50ml三、灭菌三、灭菌定义：定义：以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有微生物所有微生物（包括芽孢（包括芽孢( (休眠体休眠体) )和孢子（真菌、放线菌生殖细胞）和孢子（真菌、放线菌生殖细胞）方法方法1 1：高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下

9、维持15min15min（培养基、（培养基、无菌水、玻璃器皿等灭菌。无菌水、玻璃器皿等灭菌。P P2020），），灭菌前排出锅内冷空气，因为空灭菌前排出锅内冷空气，因为空气膨胀压大于水蒸气膨胀压，达气膨胀压大于水蒸气膨胀压，达不到水蒸气的温度。灭菌锅压力不到水蒸气的温度。灭菌锅压力与大气压相同时打开锅盖与大气压相同时打开锅盖灭菌后，通常将实验用具放进灭菌后，通常将实验用具放进60608080的烘箱中烘干，除去灭的烘箱中烘干，除去灭菌时的水分，防止污染菌时的水分，防止污染(P20)(P20)方法方法2 2：干热灭菌干热灭菌：160-170 160-170 下下加热加热1-2h1-2h。玻璃器皿等

10、耐热器具。玻璃器皿等耐热器具恶劣环境下恶劣环境下四、超净台操作四、超净台操作 无菌操作泛指在培养无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所微生物的操作中，所有防止有防止_污染污染（培养基和操作者）（培养基和操作者）的方法。的方法。杂菌杂菌1 1、紫外消毒（紫外消毒（针对空气针对空气）：实验用具放在超净台上，打：实验用具放在超净台上，打开超净台的紫外灯和过滤风（人离开）开超净台的紫外灯和过滤风（人离开）30min30min左右，培养左右，培养基冷却至基冷却至6060，关闭紫外。，关闭紫外。2 2、酒精消毒酒精消毒：用镊子取出酒精棉擦拭超净台桌面，并擦：用镊子取出酒精棉擦拭超净台桌面，并擦拭双手。拭双手

11、。3 3、开始实验开始实验_必须无菌（必须无菌（灭菌灭菌）_也必须要无菌（也必须要无菌（灭菌灭菌）_时不带入杂菌（时不带入杂菌（灭菌、消毒灭菌、消毒各种器具各种器具培养基培养基转移菌种转移菌种 灭菌与消毒的区别灭菌与消毒的区别 灭菌与消毒的区别灭菌与消毒的区别 消毒：消毒：使用使用较温和理化因素较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部，仅杀死物体表面或内部的的一部分一部分对人体有害的微生物的过程。对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和不能杀死芽孢和孢子。（孢子。（对被消毒物体基本无害对被消毒物体基本无害） 灭菌：灭菌：使用使用强烈的理化因素强烈的理化因素消灭物体内外消灭物体内外所有所有微生物，微

12、生物，包括芽孢和孢子。（细菌蛋白质变性达到灭菌目的）包括芽孢和孢子。（细菌蛋白质变性达到灭菌目的）例题：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。例题：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手实验操作者的双手答：（答：（1 1）、（）、（2 2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3 3）需要消毒。）需要消毒。无无菌菌操操作作消毒消毒灭菌灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌干热灭菌干热灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌紫外线消毒法（使

13、蛋白质变性，还能损伤紫外线消毒法（使蛋白质变性，还能损伤化学药剂消毒法（酒精）化学药剂消毒法（酒精）煮沸消毒法煮沸消毒法40050070%70%DNADNA结构结构巴氏消毒法巴氏消毒法四、超净台操作四、超净台操作倒平板倒平板制斜面：冰箱制斜面：冰箱4 4保存单菌落保存单菌落在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁，以右手，以右手无名指及小指夹持封口膜，无名指及小指夹持封口膜，右手其他三个手指拿着三右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将并打开上盖的一边，将三角瓶中培养基（三角瓶中培养基（1020ml1020ml）倒在培养皿里，将其放于水）倒在培养皿里，将其放于

14、水平位置，轻轻晃动，使培养基铺满底部，凝固形成平面。平位置，轻轻晃动，使培养基铺满底部，凝固形成平面。倒置放置倒置放置既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染. .试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多, ,不容不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。 思考题：思考题：A A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1 1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打、灭

15、菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌3030分钟。分钟。2 2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3 3、整个操作在酒精灯火焰旁进行、整个操作在酒精灯火焰旁进行4 4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B B、培养基灭菌后，需要冷却到、培养基灭菌后，需要冷却到6060后才倒平板，你后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形

16、瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 思考题思考题C C、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。DD、如何检查培养基是否受杂菌的污染？、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产

17、生将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。则未受杂菌污染。四、超净台操作四、超净台操作接种扩大培养接种扩大培养 从大肠杆菌斜面从大肠杆菌斜面锥形锥形瓶中的液体培养基瓶中的液体培养基 接种好后在接种好后在37度摇床振度摇床振荡培养荡培养12h注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.四、超净台操作四、超净台操作划线分离法划线分离法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面原理：通过接种环在琼脂固体培养基

18、表面连续划线连续划线的操的操作，将聚集的菌种作，将聚集的菌种逐步稀释分散逐步稀释分散到培养基的表面。到培养基的表面。由由于划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此最后部于划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此最后部分的细菌间距加大。分的细菌间距加大。 获得单菌落获得单菌落首首尾尾注意事项注意事项:1.接种环灼烧灭菌后要冷却，接种环灼烧灭菌后要冷却，避免温度高杀死菌种避免温度高杀死菌种1.接种环接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液,但要在但要在培养基不同位置培养基不同位置连续划线多次连续划线多次,不能不能划破划破培养基培养基.2.划线划线首尾不能相接首尾不能相接3.划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置

19、培养37，1224h第一区域第二区域第三区域第四区域第五区域注意注意1:1:不能出现线条的重叠不能出现线条的重叠注意注意2:2:第二次或随后几次的操作总是从上一次划线的末第二次或随后几次的操作总是从上一次划线的末端开始端开始注意注意3:3:最后一个区域不能与第一个区域相连最后一个区域不能与第一个区域相连 灼烧接种环冷却 划线 （第一区域）蘸取菌液灼烧接种环冷却 划线 （第二区域）灼烧接种环冷却 划线 （第三区域）灼烧接种环冷却 划线 （第四区域）灼烧接种环冷却 划线 （第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养第一次灼烧第一次灼烧每次划线之每次划线之前灼烧前灼烧划线结束灼烧划线结束灼烧目的目的避免接

20、种环上可能避免接种环上可能存在的微生物污染存在的微生物污染培养物培养物杀死上次划杀死上次划线结束后接线结束后接种环上的残种环上的残留菌种留菌种杀死接种环上杀死接种环上残留的菌种，残留的菌种，避免细菌污染避免细菌污染环境或感染操环境或感染操作者作者在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少

21、，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。单菌落分离的标志？单菌落分离的标志？ 划线的末端出现不连续的单个菌落划线的末端出现不连续的单个菌落为什么要倒置培养？为什么要倒置培养？既可以使培养基表面的水分更好地挥发，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成细菌随水扩散污染，难以分成单菌造成细菌随水扩散污染，难以分成单菌落，达不到分离的目的落，达不到分离的目的1、系列稀释操作、系列稀释操作四、超净台操作四、超净台操作涂布分离法涂布分离法2、涂布平板操作、涂布平板操作玻璃玻璃刮刀刮刀细菌

22、的分离方法细菌的分离方法划线分离法划线分离法和和涂布分离法涂布分离法。 种类种类:作用作用: 单菌落的分离是单菌落的分离是消除污染杂菌消除污染杂菌的通用方法，也的通用方法，也是用于是用于筛选高表达量菌株筛选高表达量菌株的最简便方法之一。的最简便方法之一。 划线分离法，简单方便；划线分离法，简单方便；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些单菌落培养单菌落培养试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多, ,不容易进入不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。 在无菌操作下将单菌落用接种环

23、取出，再用划线法接在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，种在斜面上，3737培养培养24h24h后，置于后，置于44冰箱中保存冰箱中保存分析与讨论分析与讨论:1、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？（1）胆大心细，操作快捷）胆大心细，操作快捷（2）注意灭菌操作原则，灭菌要彻底，尽量降）注意灭菌操作原则，灭菌要彻底，尽量降低环境污染几率，手和实验服要保持清洁，合理低环境污染几率，手和实验服要保持清洁，合理地减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到地减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到（3）注意微生物的生长条件，如）注意微生物的生长条件，如pH

24、、渗透压、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜的物质营养，喜37的温度；而霉菌喜中性偏的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25-30的温度。的温度。不仅考虑培养基成分，也要考虑理化性质：不仅考虑培养基成分，也要考虑理化性质：pH、渗透压、渗透压、温度、氧气等温度、氧气等分析与讨论分析与讨论:2、在培养后如何判断是否有杂菌污染？、在培养后如何判断是否有杂菌污染？（1）从菌落的形态看，）从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等，是区别细菌、酵母

25、菌、放线菌和呈何种颜色等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标霉菌的关键指标（2）用显微镜镜检观察其形态、大小，）用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标菌、放线菌和霉菌的关键指标（3）上述方法较难区分同类的不同菌种，这时上述方法较难区分同类的不同菌种，这时就需要借助就需要借助化学方法和进一步的形态观察化学方法和进一步的形态观察，如用，如用革兰氏染色法，观察孢子形态、孢子着生方式、革兰氏染色法，观察孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、有无鞭毛、芽孢、毒素及特异生菌丝生长方式、

26、有无鞭毛、芽孢、毒素及特异生理生化性质等理生化性质等分析与讨论分析与讨论:3、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？完成实验后，所有接触过细菌的完成实验后，所有接触过细菌的器皿器皿都必须先经都必须先经过过高压灭菌后再洗涤高压灭菌后再洗涤，特别是培养基有可能被有，特别是培养基有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体会影害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体会影响人畜健康，也会污染环境，因此必须高压灭菌。响人畜健康，也会污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的使用后的废弃物也要经过高压灭菌后再丢弃废弃物也要经过高压灭菌后再丢弃。对。对于于取样器的取样

27、头取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤器中加洗衣粉洗涤30min，再永清水洗净，仍可，再永清水洗净，仍可再用。再用。封口膜封口膜也也可重复使用。可重复使用。分析与讨论分析与讨论:4、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？证不被普通的大肠杆菌所污染？转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因的通过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质粒）转化如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质

28、粒）转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其它没有抗中生长，而未被转化的就不能生长，其它没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达量菌株等进行分离，菌后，如果为了选择高表达量菌株等进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不被普通（无抗性基因）的大肠杆菌所污工程菌不被普通（无抗性基因）的大肠杆菌所污染。染。请回答下列酵母菌有关的问题：请回答下列酵母菌有关的问题：（1 1）从生态系统的成分上看，酵母菌属于）从生态系统的成分上看，酵母菌属于 ，它的同化，它的同化作用类型是作用类型是 。（2 2）培养酵