青蒿素的发现,提取及一系列发展应用

1、青蒿素的发现，提取及一系列发展应用1. 时代背景：时代背景.mp4世界上影响人数最多的疾病并非现在深受关注的艾滋病，而是 一种堪称“历史悠久”的疾病一疟疾，也就是俗称的“打摆子”, 同时，它也是当今除艾滋病外，上升趙势最为显著的一种传染病，每 年23亿人感染此病，200多牙人5Eto 19世纪从南美洲金鸡纳射 皮中得到的奎宁曾成为最有效的药物，治愈了众多的症疾患者。20 世纪第二次世界大战后模仿奎宁基本结构而合成的一枇新药如氯隆、 伯隆也曾救治过无数的病人。但是20世纪60年代出现抗药性疟煉虫 后，以往常用的抗疟药（如氮隆、礦服、奎宁等）的效果便不复存在, 以至于造成了无药可医的局面，特别在东

2、南E、非洲地区情况更为严 重。青蒿素类药物的出现以其副作用低且不易产生抗药性而被誉为“治疗疟疾的最大希望” O2. 什么是青蒿素时代背景.mp4分子式为C15H22O5，分子量282.33，组分含量：C 63.81 %, H 7.85%, 0 28.33%。无色针状晶体，味苦O在丙附、确酸乙酩、氯仿、苯及冰酣酸中易溶，在乙醇和甲醇、乙 81及石油矗中可落解,在水中几乎不溶。aCHaO青蒿素(Artemisinin ) Q名黄蒿素，是一种具有il氧桥的倍半蒔厳类化合物。分子式为C15H22O5,分子量为282.34,具有过氧15- 酣环，有一f色括氧化物在的1, 2, 4-三恶烷结构单元，在自然

3、界 中是非常罕见的，它的分子中包牯7个手性中心。青蒿素为无色针状 结晶，熔自为156157t,易洛于氯仿、丙酗、乙酸乙酩和苯，可 落干乙醇、乙隧，微溶于冷石油8,几乎不落于水。因其貝有特殊的 过氧基团，对热不稳易受湿、热和还原性物质的影响而分解。3. 为什么要选用青蒿治疗疟疾？疟疾是一f非常古老的疾病。我们的先人对它还是有一定亦 法的。在晋代洪所着的肘后备急方中就有关于疟疾的治疗方药， 原文血下：青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。意思是，用一 把青蒿，以二升的水浸渍以后，绞扭青蒿，取得药汁，然后一次服尽。 可别小看这几旬话，它说明，我们的古人对于青蒿截疟已经有了很深 入的认识。4. 验证青

4、蒿素对疟获的治疗效果实验：为什么在实验室里青蒿的提取物不能很有效地抑制疟疾 呢？是提取方法有冋题？还是做实验的老惧有间题？“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”为什么这和中药常用的 髙温煎熬法不同？原来古人用的是青蒿鲜汁！温度！这两者的差别 是温度！很有可能在髙温的情况下，青蒿的有效成分就被破坏掉了。 改用沸点较低的乙58进行实验，她在60 fl氏度下制取青蒿提取物。 接下来在实验室里，青蒿提取物对疟原虫的抑制率达到了 100%!5. 其实青蒿素是从黄花蒿中提取而来，为什么俞名为青蒿素？在植物学睛里，青蒿和黄花蒿是同属菊科的两种植物，此后定名的青 蒿素其实存在干黄花蒿中，青蒿中反倒没有。而在

5、中医药领域，青蒿 和黄花蒿却被貌称为青蒿。中药研究所提取“青蒿素II”晶体并将其命名为青蒿素 时间最早，但省药物研究所改进了提取方法，采用“溶剂汽油法”大 幅提髙了提取效率，并且确定了优质黄花蒿产地，“523任务”后续 进行的动物药理毒性试验和临床试验研究，用的其实那是“黄蒿素”。 青蒿素命名的“青黄之争”，成了一场纠缠不清舸“文字官司”。直 到1978年，"523"顶目科研成果鉴定会上，按中药用药习惯，将中 药青蒿抗疟成分定名为青蒿素。但争议并未止朋，以至于2000年版的中国药典中还在为此 做着修正：将中药青蒿原植物只保留黄花蒿一种。6青蒿素的提取：青蒿素虽然已经可以人工

6、全合成，但其成本很高，无法 工业化生产。目前，青蒿素的主要来源仍然是从植物黄花蒿中提取分 离。黄花蒿分布较广，但由于产地的不同，所含青蒿素的差异极大 (0.1% -1.3%)其中仅有部分产地(、XX、等地)的黄花蒿具有工 业价值。青蒿素原料药的90%来自中国。最早用乙隧提取：髙温会破坏青蒿中的有效成分，® 即另辟蹊径采用低沸点落剂乙隧进行实验。以草取原理为基础，挥发 油主要采用水蒸汽蒸翔提取，减压蒸幡分离,其工艺为:投料一加水 -蒸锚一冷却一油水分离一精油；非挥发性成分主要采用有机溶剂提 ®, It层析強重结晶分离，基本工艺为：干爍一破仰一浸泡、萃取（反 复进行）一浓缩提品

7、一精制。目前从黄花蒿中提取分离青蒿素的方法主要有：超临界二氧化碳提取法丙B-6IR柱层林法低沸汽油-超短机型球状扩空畦胶过滤柱层析法稀乙醇渗漉-连续萃取法5撤波提取法6 , 7石油肛超声波提取法8乙血冷浸法9最早使用方法溶剂汽油提取-浓缩-结晶法10Vonwille的甲醇-乙醉一乙籬提®I法11Paniego的新鲜组级甲苯提取法12Elsohly等的正己烷-乙瞻法13其中溶剂汽油提取-浓缩-结晶法操作简便、成本低 廉、是大多数提取生产家广泛采用的方法。7. 青蒿素对疟疾的作用机制：摘要青蒿素是中国自主研制的抗疟良药，髙效、低毒，许务基干青蒿素研发的师生物具有良好的抗疟效果，近年来已

8、成为抗疟的一线药物，受到世界医疗卫生界的充分肯定.虽然青蒿 素作用机制青蒿素结构奇特，抑疟效果显着，但40年来其生物作用 机M之趟一直未被IM底破解针对血红素青蒿素类药物的作用机制, 提出了不同的假说，如血红素参与青蒿素的激活并被烷基化从线粒 体而起到那疟作用，线粒体参与青蒿素的激活和作用过程，某些特定 的蛋白是青蒿素作用靶点等除那疟外，青蒿素类药物在杀灭其他 种类寄生虫、那制某些癌症细胞以及抗病毒、治疗类风湿等方面也 有一定作用.下面将对青蒿素类药物作用机制的研究进行综述及展 望，包括抗疟疾过程中的药物激活、作用靶点 破解青蒿素作用机制不仅可以加深人们对这种药物的认识，而冃对干其正确使用，如

9、增效、肪止按芜株舸产生，以 及新型抗疟药物的设廿部有重要意文.目前提出的青蒿素作用机制假 说基本涉及两个方面：青蒿素的激活和青蒿素的作用靶点.青蒿素的激活：(1) 鉄参与青蒿素的激活.青蒿素抗疟研究中,鉄是大家关注的焦点 之一.目前，一种比较普遍的观点是青蒿素的激活是通过含铁的途径 进行的通过监测青蒿素产生自由基的过程认为，鉄在青蒿素抗疟过 程中发挥了重要作用.通过电子顺險共振技术(EPR)K捕获剂DMPO 进一步揭示了二者之间的关系，失去鉄离子的参与，青蒿素的作用效 率大大降低(2) 血红素(heme)参号青蒿素的激活：有体外实验发现，將青蒿素与不同形式的铁，包扌舌血红素、二价铁离子、脱氧的

10、和氧化的血红蛋白在相同的条件下进行反应，血红素与青蒿素反应的效率远髙于其他含挟分子12,表明血红素对于激活青蒿素起关傩作用.疟原虫寄生于血红细胞中，血红素来源丰富.目前，究竟是自由铁还是血红素的铁激活青蒿素还存在争议(3)线粒体参弓青蒿素的激活履其他观自青蒿素类药物的作用靶点：嵌人在青蒿素倍半烯站酯骨架中的双氧桥 对青蒿素抗疟有着至关重要的作用是进行机制研究的最初线索，而 自由基的生成与双氧桥的断裂有着密切的关系.(1) 血红素的烷基化.不少研究认为，血红素既是激活青蒿素类药物 的裂解还原激活剂，Q是其发挥作用的重要靶林，青蒿素对血红素 的修怖、烷基化是杀灭疟原虫的原因.早期的血红素模型中青蒿

11、素 的作用机制与奎宁相仿，那是作用于液泡，通过影响血红素的肮毒 来抑制青蒿素.这一观点有一些相关实验支持(2) 蛋白靶点理论.青蒿素的一个鲜明特点就是对疟原虫有强烈的 特异性而对人不产生副作用，这使得人们推测青蒿素可能会在疟原 虫体特异激活，或者症原虫体存在着对青蒿素的特异性靶标.对于 大部分药物来说，部存在着较为专一和特异的靶标(3) 线粒体模里学说 疟原虫的生长需要相关线粒体的参与其他学说8. 青蒿素及其衍生物的发展:青蒿素具有水溶性差、热稳定性差的缺点，制成片剂因其难溶性， 生物利用度低,且体代快。而纳米青蒿素的水溶性好，制成针剂后可 进行静脉注射，將极提高药效，誠少用药量，扩大应用围。

12、青蒿素由于存在近期复燃性髙、在油中和水中的溶 解度低以強难以制成合适的剂型等不足,需对其结构进行改造,以期在 保持青蒿素优良药理作用基础上开发新药，进一步改善和提髙药效。 而合成青蒿素祈生物蒿甲酣、蒿乙8、青蒿JHh双氧青蒿素等克服 了青蒿素复燃率髙的弊病。蒿甲聲其抗疟作用为青蒿素的10至20倍,目前其开发成功的剂型蒿甲SI注 射裁为主耍含蒿甲II的无色或裁黄色澄清灭菌油溶液。图1 蒿甲醴的合成路线可修编.抗疟作用稍逊于蒿甲SL且蒿ZBI的生产不如蒿甲U更经济实用。H匚：?= +Hoch3 面甲魅比青蒿素有更强的抗疟作用，它由青背素经關氢化钾还原而获得。青嬴素卿青爲進9. 青蒿素及其师生物的其

13、他药理作用:抗病原徹生物：本品煎剂对表皮葡萄球炎、卡他球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌有较强的抑制作用抗白U1病：青蒿生物对白血病P388细胞有明显的抑制作用，青蒿B衍生物亦有此作用。抗肿瘤体和体外实验证实，青蒿素及其衍生物对多种人类和动物肿痼细胞 均貝有毒性作用，包括黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿 瘤细胞、肺癌细胞等。而冃同一种術生物对不同类型肿瘤细胞的作用 强度不同，具有选择性。在一顶体外抗肿瘤实验中发规，青蒿號酩对 肠道卿瘤细胞和白血病细胞 的抑制作用较强，而对師小细胞癌细胞的杀伤作用较弱。不同衍 生物的抗肿瘤活性有所不同，具有选择性，推渭其原因可能是来源干 它们的亲脂性不同。其抗霜活牲

14、与化合物的构象、靶蛋白的差异相 关。2.1诱导卿腐细iiISJtYamachika等13系统比较了青蒿素和常规化疗 药5-氟尿瞻喘(5-FU)对口腔癌细胞IHGK的影响，发现青蒿素不同 于5-FU对细胞的直接杀伤作用，其主要作用是诱导肿瘤细胞澗 to Singh等14报道青蒿素可以诱导类人淋巴伶细胞Molt-4细 胞凋亡，而不是坏死o而且在跌转运蛋白的怵助下，青蒿素的诱导 凋亡作用更显著。青蒿素折生物青蒿號酩不但能抑制人肝癌细胞 H22和BEL-7402的憎殖，而且能诱导肿瘤细胞凋亡。进一步研究 发现，诱导的捌亡与Bcl-2基因、PA基因表达下调和bax蛋白表 达升髙相关oEfferth等15

15、分析了青蒿素对55种人肿瘤细胞相关 基因的影响卫些基因包牯药物抵抗基因、DNA损伤与修复基因、 潟亡调控基因、憎殖相关基因、原癌基因、肿瘤101制基因和细胞因 子基因。最近Disbrow等16的研究表明，两种青蒿素折生物二氢 青蒿素和青蒿號酩均对人类乳头痫病毒的宫颈上皮细胞具有毒性作 用;对徊口腔乳头瘤病毒诱导的口腔癌形成也具有抑制作用。进一 步发现这种篮水性的药物可以自由穿透上皮细胞表面，从而诱导线 粒体半胱天冬爾表达进而启动细胞凋亡，而且这一凋亡过程是P53 蛋白非依赖性的，表明青蒿素強其何生物可以用来预IT和逆转病 毒介导的肿瘤病变。2.2二价鉄离子介导的细胞毒作用青蒿素及其衍生物的抗肿

16、瘤作用机制目前还 不完全清楚。但大量证据显示，青蒿素的抗肿瘤作用机制与其抗疟 机制十分相做。研究表明，二价铁和铁转运蛋白在红细胞和肿瘤 细胞中舸含量较正常细胞髙。处于对数生长期的细胞对二价铁离子 的吸收逐步增M，而肿瘤细胞铁离子舸吸收与肿瘤细胞I曾殖呈正相 关。二价铁参与了青蒿素的抗疟作用，同样也可能介导了青蒿素对 肿瘤细胞的毒性作用。首先，跌传递蛋白基乙酸亚铁能显 著憎加青蒿素等衍生物的细胞毒性作用，对两种肿瘤细胞 CCRF-CEM和U373的细胞毒性与单用青蒿素比较增加了 1 .3 1.5倍，但对正常人外周血单个核细胞没有影喑,可能原因是外周血 单个核细胞膜上转铁蛋白受体表达量不足廉瘤细胞

17、的1 .3%。将外 温性的铁转运蛋白和青蒿素共价耦朕后，再与肿瘤细胞孵育可以大 大提髙青蒿素杀伤肿瘤细胞的效率。其次，铁转运蛋白可w mn青 蒿素对耐药師癌细胞株H69VP的杀伤作用，而不是非耐药细胞株 H69。此外，肿瘤细胞不仅仅高表达铁转运蛋白，而且高表达转铁 蛋白受体。转铁蛋白受体介导了细胞对铁离子的吸收和利用过程; 抗转鉄蛋白受体单克隆抗体RVS10能逆转铁转运蛋白协同青蒿素 杀伤CCRF-CEM和U373细胞的作用18 o McCarty等19的研 究表明，抗H1管生成药物治疗会上调肿瘤细胞低氧诱导因子 KHIF-1）的表达謔加重了肿瘤治疗的负担，因为HIF-1表迖与耐药 相关，并增

18、加转挟蛋白受体表达。但这恰恰扩大了青蒿素洽疗耐受 性肿瘤的空间。2.3氧自由基介导的细胞毒作用已经发规亚铁离子的氧化还原特性可以塔 加肿瘤细胞对il氧化氢的敏感性，而肿瘤细胞一旦缺少细胞鉄，就变 得对过氧化氢不敏感性。以前认为，过氧化氢和青蒿號酝部可以 产生ROS和自由基。对过氧化氢抵抗的卿痫细胞同样对青蒿號陥 不敏感。因此,推测与青蒿素杀死疟原虫的机制类似，肿瘤细胞的二 价鉄可以催化青蒿素类物质的il氧桥裂解，产生夫量以青蒿素炭 原子为中心的自由基和ROS o自由基破坏了肿瘤细胞膜即导致细 胞物质外漏，从而杀死肿瘤细胞20 o2.4抑斟血管生成Wartenberg等21报道青蒿素可以抑制正常

19、小鼠 驱胎血管生成，并憎加血管通透性，同时下调HIF-1 、U1管皮生长因 子(VEGF)fH基质金属蛋白阳2(MMP-2)的表达。而自由基清除剂如 维生素E可以逆转青蒿素的抗血管生成作用。这些结果表明青蒿素 的抗U1管生成作用与其产生的自由基密切相关。在对肿瘤血管生成 的研究中，Chen等22报道了二氢青蒿素和青蒿素均可那制人脐 静脉皮细i(HUVE)的增殖、if務和管状形成。进一步研究发现，另 一何生物青蒿琥菌能显著降低人卵巢肿瘤细胞HO-8910异体移植 的小鼠肿瘤组纵微血管密度(LVD),对肿瘤细胞、HUVE的VEGF K 其受休血管皮生长因子受休(VEGFR-1)的表达均具有那制作用

20、。其 中对VEGFR-2的抑翎率可迭到80 %;而青蒿號陥和二氢青蒿素及 合成的青蒿素衍生物在绒毛膜尿囊膜血管新生模型中也具有相做的 作用，但它们的作用强度有所不同。2.5増加笊化疗敏感性研究还发现，青蒿素及其何生物不仅能单独作用于肿 痫细胞，而冃与5-FU、毗柔比星、阿霉素等抗肿腐药物貝有协同 抗肿瘤作用。Kim等23最近发现，二氢青蒿素可憎Jill神经阪质 瘤细胞U373MG的笊射敏感性，其机制可能与青蒿素增加ROS生 成及抑制谷酬昔肽转移li(GST)的表达相关。最近，美盛臥大学的 Singh Q发现二氢青蒿素可以与另一抗炎物质丁酸具有协同抗肿 腐作用。丁酸是大肠细菌群合成的短讎、貝有抗

21、炎作用的脂肪酸，对 正常结肠上皮细胞具有营养作用。将20 M mohL -1的二氢青蒿素 和1 mmohL -1的丁酸与Molt-4共孵育24 h JI乎可以杀死所有 的卿瘤细胞，而20 n mohL -1的二氢青蒿素和1 mmol*L -1的丁 酸对肿瘤细胞的杀伤率分别为40%和32%24 o同时发现药物诱 导的凋亡明显增强。10 开发植物界以外的青蒿素的新药源青蒿素的药温主要取自野生黄花蒿和人工栽培的黄花 蒿，但前者受地理坏境与季节限制，而且天然资漓逐赶匮乏；后者种 植占地大，耗力费吋，加以植株易变异，产量不昵稳定，因此迫幼需 要开拓青蒿素的新药温，酉皿享有“世界青蒿之乡”的美誉，是世 界

22、上最主要的青蒿生产基地，也是全球青蒿素高含量的富集区，平均 青蒿素含量髙达8%。，全球八成的原料青蒿产于酉阳。3.1化学合成1986年，中国科学院有机化学研究所许杏祥等16以R(+)2香草軽为原料,经13-14个步骤完成了青蒿素的化学合成.近年来，青蒿素分子的全合成研究虽已取得不少进展，但距商品问世尚有待时日.2个乙MCoA乙酰乙酰CM硫解酶乙醜乙酰CoA 乙酰CoA、| HMGCoA合酶3-轻基亠甲基戌.单酰CoA(HMC；-CoA) | HMG-CoA还原酶* 甲径戊®(MVA)|焦磷酸化MVA-5-焦磷酸I脱瘦脱水作用异构化异戊烯基一a二甲基烯丙呈焦磷懺DAMPP)犍牛儿璧焦磷

23、酸(GPP)| FDP合酶水 法呢基焦磷ffi(FDP)鲨烯合酶J咅半虧合酶*型类化合物一鲨烯涪半话类中间产物焦磷»(TPP)3.2生物合成青蒿素的生物合成內括3条途径3:1)添加生物合成的前体以提高青蒿素的含量；2)调控参与 青蒿素合成的关键阳活性，或激活该阳的控別基0; 3)采用基因工程技术进行生产.有机化学所汪献、黄敬坚等17,18探索了由2214C2MVA(甲 基二好戊酸)为前体合成青蒿嚴，媒而生物合成青 蒿素与青蒿素B的过程.2011年Farhi等19另辟 蹊径，成功皿建了甲婷戊酸-青蒿素的基因工程途 径，从熠草生产青蒿素.生物合成:愈仿组级诱导丛生芽、发根培养、组合生掏合

24、成等"；矶BALDH1RED1HOOC一毎占西M盜H氏IM2(MS 连、Y MEP 堆毎I "一】PL叶戊烯儿倔収1 FPSi|«|AjAtlU偸賊S) 1扃越淒生物令成;途彳至Fiff. 1 Bio?cyiitlicsis p atliw ay of ar temixinin青蒿素的含量受地理环境、采集时期、采集部位、气温和施肥等因素的影响。黄花蒿广泛分布在中国的各省市，不同产地青 蒿素含量差异显著,最髙可达干重tfj 1% - 2% o为获得最大的青 蒿素产量，押风林等8 对不同生长期的青蒿素含量变化进行考察, 认为黄花蒿的采集期在生长盛期至花蕾期之前，此时的

25、青蒿素含量 最髙，营养体重量大，而冃采集的时间以晴天中午12时汝下午16 时为宜，一天中在这期间采收青蒿素含量最高謔与光强有利于青蒿 素的产生和大量枳累理论相一致。在黄花蒿植株和枝条上的叶片中, 青蒿素含量均呈下部、中部、上部依次递憎的规律。因此,黄花蒿a 物的上部和枝条上部的叶片应首选入药，其次为中部，最后才是下 部。不同的干煤方法对青蒿素的产量也有一定舸影响，比较晒干、 阴干和60T煤干三种方法，以自滋晒干的效果最好，比阴干的样品 含量高23. 76% o在人工栽培中稍加肥料，黄花蒿植株高大，青蒿素的含 量较野生的略髙，且嫩叶比老叶的含量高。福泰9在人工控制的坏境 中栽培黄花蒿，在黄花蒿生

26、长的基本条件得到满足的情况下,生长环 境中的营养物质的含量勺生长基质对青蒿素含量没有影响，而高温和 短距离光照可保使青蒿素含量成倍iOo Elhag等10筛选髙产的 黄花蒿植株时，发现青蒿的含量高的植株具有长的节间，茁牡的茎杆， 仲展开的枝条和茂密的叶。Liersch等11 对筛选的青蒿品种811 喷洒植物激素chlo rmequat,结果植株的青蒿素含量比对照髙 30%。虽然青蒿素主要来自于天然采集的野生植株和人工栽培青蒿, 但天然野生青蒿受地理坏境和季节的限制以及童淵的日益匮乏，难 以获得持续的发展。人工栽培占地大，耗时耗力，且植株易变异，也使 得产量难以保证，因而开发新的青蒿素来温途径具

27、有重要的实廉意 艾。青蒿素及其衍生物的展望:青蒿素产业的发展需要各方面共同促进。通过遗 传改造快速获得高青蒿素含量的植株將是高产黄花蒿育种的主要方 向；土壤中吧料的多少对青蒿素含量的影响不大，但外界坏境 的刺激能显著改变青蒿素含量，特定条件下青蒿素含量的变化將是 黄花蒿髙产栽培技术的重要研究方向；由于青蒿素在黄花蒿中含量 很低，在提取青蒿素时大量废料的产生不可避免，这也是青蒿素 生产成本一直较髙的原因之一，对废料的再和用將有利于节约生 产成本；青蒿素的质量控制头开始，黄花蒿的栽培地应选 择在士壤与周边环境良好的地区，并加强田间管理，名施用有 机肥改善士壤条件，选择绿色生物农药，而溶剂残留间題可

28、以 通过优化现有工艺、严榕规生产或使用新型技术进行控制O青蒿素产业的发展也离不开相关功能和产品的研究开 发。结合市场需求，青蒿素低成本生产汝其新功能舸挖掘与刊用将 是黄花蒿青蒿素开发利用的发展趙势。青蒿素在黄花蒿中含量很 IK ,在人工大规模化学合成还无法实现的情况下，使得青蒿素的 开发利用受到极大眼制。虽然采用工程菌蒲助发醉完成青蒿素体 外生物合成是一个有效解决原料难题的方法，但要达到一步式直接 生物合成青蒿素，还需要更务的探索。由于青蒿素的天然产物提取 生产成本很高，能否从根本上解决原料中青蒿素含量低的间题， 已经成为制约我国青蒿素天然产物提取行业发展的重要珈颈。由此 可见，选育髙青蒿素含量的优良品种至关重要。相对于传统育 种方法后代遗传性状不稳定、育种所需年限长、工作量大的缺点， 基因工程育种能定向进行遗传改造,大大缩短育种年眼,且效果 明显。青蒿素的生物合成是一系列复杂的反应过程，有多种中 间产物和多条分支途径，这也是青蒿素生物产量低的根本原因。 要促进青蒿素的枳累，“开iir 与“截流”是两大重要策略。 通过过表达技术促进主干流的枳累与反义RN A技术抑制支流的消 耗来共同促进青蒿素舸生物合