环境微生物基础实验讲义

1、天津工业大学环境与化学工程学院环境微生物基础实验讲义目 录实验一、光学显微镜对及各类微生物的形态观察实验二、细菌染色方法及鉴定实验三、培养基的制备和灭菌及细菌接种技术实验四、土壤中微生物的分离、纯化及培养技术实验五、细菌菌落总数（CFU）的测定实验六、叶绿素a法进行富营养化湖中藻类的测定实验一、光学显微镜对及各类微生物的形态观察一、 实验目的（1） 掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。（2） 观察大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉、曲霉、根霉、霉菌、链球菌、酵母菌、白假丝酵母的个体形态，并绘制生物图。二、 仪器与材料（1） 显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、镊子。（

2、2） 蒸馏水、二甲苯、香柏油、擦镜纸。（3） 结晶紫染液、藩红染液、碘液，乙醇（95）、石炭酸液。（4） 菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、微生物示范片及新鲜斜面菌种三、 实验内容及步骤一 显微镜的结构、光学原理及操作方法1.机械装置（1）镜筒：镜筒上端装目镜。下端装转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式和后斜式。（2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有孔，不同规格的物镜分别安装在各孔上。（3）载物台：载物台为方形和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器，可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用的。（4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器，有固定式和调

3、节式两种。（5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。（6）调节器：包括粗、细螺旋调节器各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。2.光学系统和光学原理（1）目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜（2）物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍、高倍及油镜。物镜的性能由数值孔径决定。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（镜口角，）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过

4、载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55m。当使用数值孔径（N.A）为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42m；而使用数值孔径（N.A）为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22m。显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离的能力。值愈小表明分辨率愈高。值与光线的波长（）成正比，与物镜的数值孔径（N.A）成反比。（3）聚光器: 聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到样

5、本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可上下调节，中间装有光圈，可调节光度。（4）反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。（5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某些波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和分辨率。二 显微镜的操作方法1.低倍镜的操作（1）置显微镜于固定桌上。（2）旋动转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。（3）转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜，仔细观察。（4）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中央。（5）将粗调节器向下旋转，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。（

6、6）左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转。如果粗调节器旋的太快，使超过焦点，必须从第五步重调。（7）观察时两眼同时睁开。2. 高倍镜的操作（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正中央。（2）旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调，如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。3. 油镜的操作（1）如果高倍镜的目的物没有看清，用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本，将目的物移到视野正中。（2）提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。（3）从侧面注视，小心慢慢降

7、下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。（4）将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。（5）再次观察，提起镜筒，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。三 镜检完毕后的工作1移开物镜镜头。2取出装片。3清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸

8、擦干残留的二甲苯。4擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。注意事项：1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察2下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。四 菌体形态观察按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序逐个观察杆

9、菌、球菌、芽孢杆菌、酵母、霉菌等微生物示范片，用铅笔在实验报告中绘出微生物形态图。思考题：1. 绘制微生物的形态图。2. 为什么要用油镜观察细菌的形态？15实验二、细菌染色方法及鉴定一、 实验目的(1) 学习微生物的染色的原理，染色的基本操作技术。(2) 学习细菌简单染色步骤及革兰氏染色的方法。以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为菌种，进行菌体染色；通过革兰氏染色的方法鉴别革兰氏阳性菌和阴性菌。二、 仪器与材料(1) 显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、镊子、酒精灯。(2) 蒸馏水、二甲苯、香柏油、擦镜纸。(3) 结晶紫染液、藩红染液、碘液，乙醇（95）、石炭酸液。(4) 菌种：枯草杆菌、大肠杆菌新鲜斜面菌

10、种四、 实验内容及步骤一 简单染色（1）涂片：在洁净的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种针以无菌操作从菌种斜面上取少量大肠杆菌或枯草杆菌菌体与水混合，涂成均匀的薄层。（2）固定：将涂片放在离火焰较远处，以微热烘干，温度以不烫手为宜，烘干后再在火焰中快速通过34次，使菌体完全固定在载玻片上。（3）染色：用结晶紫浓染液染一分钟。（4）冲洗：倾去染液，斜置载玻片，用水冲去多余染液，流出的水无色为止。要注意不能将水直接冲在涂菌的位置（5）干燥：用微热烘干或自然晾干或在微笑火焰上方烘干。（6）镜检：先用低倍镜找到部位，再用高倍镜、油镜观察。二 革兰氏染色（1）涂片、固定：同上，菌种用大肠杆菌和枯草杆菌。（

11、2）染色：将经固定后的涂片用结晶紫染液染1分钟，水洗，干燥。（3）媒染：用碘液媒染1分钟，水洗，干燥。（4）脱色：连续滴加95乙醇使其脱色，直至滴下的乙醇无色为止（约0.5到1分钟），水洗，干燥。（5）复染：用番红复染1分钟，水洗，干燥。（6）镜检：用高倍镜及油镜观察染色情况，革兰氏阳性（G+）呈紫色；革兰氏阴性（G-）呈红色。思考题：1. 革兰氏染色法的原理是什么？2. 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各是什么性质的细菌？实验三、培养基的制备和灭菌及细菌接种技术一、 实验目的（1） 熟悉微生物实验用各类玻璃器皿的洗涤、包装，棉塞制作和灭菌前的准备工作；（2） 学习各种培养基的配置方法，掌握肉膏蛋白胨琼

12、脂培养基的制备方法；（3） 学习高压蒸汽灭菌的方法及蒸汽灭菌锅的操作方法；学习干热灭菌的方法并对培养皿、移液管等玻璃器皿进行干热灭菌。（4） 掌握斜面接种技术。二、 仪器与材料（1） 无菌培养皿，90×，10套、无菌移液管1ml，10支，10ml 1支，试管15mm×150mm，10支，三角瓶150ml，250ml各两个。（2） 营养琼脂培养基1瓶，精密试纸6.48.4，10%HCl，10%NaOH。（3） 接种针，酒精灯，托盘，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，烘箱。（4） 棉花，脱脂棉，纱布，线绳，牛皮纸，电炉，烧杯，量杯。三、 实验内容及步骤一 玻璃器皿的洗涤和包装（1）

13、洗涤。对实验所用的玻璃仪器进行洗涤，烘干。（2） 包装。包装玻璃仪器是为了在灭菌的过程中对其进行保护。实验中学习对移液管进行包装，单根移液管包装后，待灭菌。移液管的包装：洗净烘干后的移液管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约45厘米，以45°左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。试管和三角瓶

14、的包装：试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。（3） 棉塞的制作。棉塞用于试管、三角瓶的包装。棉塞制作后塞在试管或三角瓶瓶口，最后用牛皮纸包好后用细绳扎好，待灭菌。二 培养基制备和灭菌（1） 斜面的制备。实验可以用营养琼脂配置培养基，这种培养基可用于大多数细菌的培养。也可以按照待培

15、养菌种的特性，配置特定培养基。培养基溶液配置后，需调节pH，进行过滤和分装。对于制备斜面培养基，要将培养基溶液分装到试管里。分装的方法为，试管里培养基长度为试管长度的1/31/2之间，赛好棉塞后，十支试管为一捆用牛皮纸包好，用细绳捆扎，待灭菌。（2） 灭菌。加热灭菌的方法一般有干热灭菌法和湿热灭菌法。高压蒸汽灭菌法比干热灭菌优越，一般用于液体培养基的灭菌。干热灭菌法：用烘箱进行，温度160维持2h，灭菌的物品为培养皿、试管、移液管等玻璃器皿。湿热灭菌法：高压蒸汽灭菌法，需应用高压蒸汽灭菌器进行，用于微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温除外）。高压蒸汽灭菌器有各种形式及规格。下面以常

16、用的高压蒸汽灭菌锅为例进行介绍。高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的耐高温和耐高压的双层金属圆筒，两层之间盛水。外锅：供装水产生蒸汽之用。坚厚，其上方或前方有金属厚盖，盖有螺栓，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢。加热后，灭菌器内蒸汽压力升高，温度也随之升高，压力越大，温度越高。外锅壁上还装有排气阀、温度计、压力表及安全阀。排气阀用于排出空气；压力表：以表示锅内压力及温度（公制压力单位为公斤/cm2、英制压力单位磅/英寸2、温度单位）；安全阀又称保险阀，利用可调弹簧控制活塞，超过定额压力即自行放汽减压，以保证在灭菌工作中的安全。内锅：为放置灭菌物的空间。高压蒸汽灭菌锅的使用方法：3. 使用前的准备：灭菌器内清

17、洗干净，检查进气阀及排气阀是否灵活有效，并加入适量水。4. 装放灭菌物：将待灭菌的物品放入灭菌器内，注意不要放得太挤，以免影响蒸汽的流通和灭菌效果。然后加盖旋紧螺旋，密封。5. 预热及排气：加热升温使水沸腾，并由小至大打开排气管（排气阀），排除冷空气，继续加热升温，再关闭排气管。6. 升压保温：让温度随蒸汽压力增高而上升待压力逐渐上升，待蒸汽压力升至所需压力(一般为103.43kPa，温度则相当于121.3)时，控制热源，维持所需时间，持续1520min即可达到灭菌目的。7. 降压开盖取物：保压到规定时间之后，就停止加热，缓缓排气，待其压力下降至零时，方可开盖取物。8. 注意事项：此法灭菌是否

18、彻底的一个关键是压力上升之前，必须先把蒸汽锅内的冷空气完全驱尽，否则，即使压力表已指到103.43kPa，而锅内温度则只有100，这样芽孢则不能被杀死，造成灭菌不彻底，所以必须进行排气。降压一般通过自行冷却。如果时间来不及，可以稍开排气阀降压，但排气阀不能开得太大，排气不能过急，否则灭菌器内骤然降压，灭菌物内的液体会突然沸腾，将棉塞冲湿，甚至外流。另外，降压时压力表上读数虽已降至“0”时，灭菌物内温度有时还会在100以上，如果开锅太快还有沸腾的可能，所以最好在降压后再稍停一会，灭菌物温度下降后再出锅较妥当。灭菌物灭菌后仍处于高温时，容器内呈真空状，降温过程中外部空气要重新进入容器。一般叫“回气

19、”，降温过快，回气就急，如棉塞不严密，空气中杂菌就会重新进入灭菌物使其污染，这往往造成高压蒸汽灭菌的失败。因而降压开盖取物不宜过急。三 细菌的接种技术实验的目的和所研究的微生物种类、所用的培养基及容器不同，接种的方法有很多。主要有斜面接种技术、液体培养基中菌种的接入技术、液体接种、穿刺接种、稀释平板涂布法。本实验中主要学习斜面接种技术。斜面接种的方法：这是将长在斜面培养基（或平板培养基）上的微生物接种到另一支培养基上的方法。操作方法：接种前桌面擦净，并用酒精擦拭消毒。待接种试管贴好标签，注明菌种名，接种日期，接种人，组别，姓名等。点燃煤气灯，将一支斜面菌种和一支待接斜面培养基放在左手上，拇指压

20、住两支试管，中指位于两支试管之间，斜面向上，管口齐平。右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红，伸入试管中部分均应灼烧以达灭菌目的。火焰旁，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞后拔出，试管口在火上微烧，将烧过的接种环伸入试管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划出曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞并插入试管架上，最后再次烧红接种环，接种完毕。思考题：1. 无菌操作的注意事项？2. 高压蒸汽灭菌法的原理？实验四、土壤中微生物的分离、纯化及培养技术一、 实验目的（1） 掌握从环境(土壤、水体、活性污泥等

21、)中分离培养细菌的方法；（2） 掌握平板划线法并对细菌进行分离操作。二、 仪器和材料（1） 无菌培养皿，90×，10套、无菌移液管1ml，2支，10ml 1支，三角瓶150ml，250ml各两个。（2） 营养琼脂培养基1瓶，精密试纸6.48.4，10%HCl，10%NaOH。（3） 接种针，酒精灯，托盘，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，烘箱。（4） 棉花，脱脂棉，纱布，线绳，牛皮纸，电炉，烧杯，量杯。三、 实验步骤一 土壤稀释液的制备1. 取适量土壤，将其分散到灭菌后蒸馏水中，制备土壤稀释液。二 微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法

22、。实验中学习平板划线法对菌种进行分离。菌种选用活性污泥或土壤悬液等。先学习制作平板。平板制作：将融化并冷却至50的培养液倒入无菌培养皿中，使凝固成平板。接种：用接种环挑取一环活性污泥，左手拿培养皿，中指，无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线，划线方式可取斜线、直线等。划线后盖好皿盖，倒置，30培养2448h后观察结果。思考题： 1. 平板划线法操作注意事项是什么？实验五、细菌菌落总数（CFU）的测定一、 实验目的实验中掌握倒平板技术及水样稀释方法，熟练无菌操作技术。学习细菌的平板计数的方法，根据待培养菌体

23、进行培养基的设计及制备。根据计数结果正确书写菌落总数报告。二、 目的和原理水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关，它是评价水质污染程度的一个重要指标之一。本实验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是一种测定水中好氧的和兼性厌氧的异养细菌密度的方法，由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细菌总数是指1毫升水样在营养琼脂培养基中，37、24小时培养后所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水中总菌数不得超过100个。三、 材料

24、和器皿（1） 培养基：营养琼脂培养基（2） 无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养皿，盛有90ml及9mL灭菌蒸馏水的锥形瓶和试管。四、 方法和步骤（1）采集水样。（2）吸取10 ml水样（河水、污水、游泳池水或港湾水等），注入盛有90ml无菌水三角瓶中，混匀成10-1稀释液，在吸水样前，水样应彻底搅动均匀。（3）按10倍稀释法将水样稀释成10-2、10-3、10-4。（4）根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4稀释度；中等的选取10-1、10-2、10-3稀释度，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1ml。稀释度的选择是测定精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于3030

25、0个之间。（5）注入彻底融化，然后冷却到45的营养琼脂培养基约15ml，立即旋摇培养血，充分混匀，水平放置至固化。取同一稀释度的平板培养物，依菌落计算原则进行计算。（1）菌落计算原则平皿菌落的计算，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。记录同一浓度的三个平板的菌落总数，计算平均值，再乘以 稀释倍数即1ml水样中的细菌菌落总数。（2）计算方法首先选择平均菌落数在30300者进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。若有两个稀释度的平均菌落数都在30300之间，则应按两者的比值来决定。若其比例小于2，应报告两者的平均数；若大

26、于2，则报告其中较小的数字如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如果全部稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。菌落计数的报告，菌落在100以内时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。思考题：1. 测定水样中的细菌菌落总数的意义？2. 将水样的测定结果报告，并给出结论？实验六、叶绿素a法进行富营养化湖中藻类的测定一、 实验目的（1） 正确进行待测样品的取样，配置测定用各种试剂及药品；掌握水样的过滤及提取方法