液相流动相缓冲盐选择

1、下表是 Waters提供的一个资料，常规实验室建议使用的缓冲盐体系F面内容综合了 Agile nt和网上查到的一些资料:一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和 乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性 高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法 的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样 品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈， 少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离

2、不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因 为不同的溶剂可提供不同的选择性。在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的 耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在 pH24的条件下，保留时间 对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一 pH范围作为大多数样品方法开发的 起始pH,包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以 上流动相pH (如和缓冲盐溶液)，可提供最好结果。对流动相的优化主

3、要体现在水相上。流动相 pH值对色谱分离的影响有多钟方 式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较 强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离子化的化合 物，如酸或碱，保留因子和选择性随 pH改变非常明显。(1) 酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa,才能有效的选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值土 1 pH 单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为，缓冲范围为。(2) 碱性化合物，在高pH条件下才能得到其非离子形态，但这对色谱柱不 利。通常许多碱性化合物在低pH条件的保

4、留就已经满足要求了，所以可选择低 pH 条件。如果选择高pH条件，则注意需选择耐强碱的色谱柱。水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变 pH值、改善峰形、提高分离度。常 用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时，低 波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸。开发液相分析方法 时流动相可首选的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时 候再考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简 单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠 盐，还有醋酸盐，常用的盐浓度在 1020mM左右(根据实际情况，有时可

5、以选择更 低或更高浓度，建议最高浓度不超过 50mM。缓冲盐/流动相改性剂pKa缓冲范围性？(±1pH)是否MS兼容？备注TFA-是是离子对试剂，能够抑制MS信号，通常使用的浓度范围%乙酸-是是同乙酸铵一起使用具有 最大的缓冲能力，通常 使用的浓度范围%甲酸-是是同甲酸铵一起使用具有 最大的缓冲能力，通常 使用的浓度范围%乙酸盐（铵盐）是是通常使用110mM浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的甲酸盐（铵盐）是是通常使用110mMfi度，注意钾盐和钠盐是非挥 发性的磷酸盐1否否传统的低pH缓冲体系，UV透光度很好磷酸盐2否否当pH超过7时，降低操 作温度/缓冲盐浓度以及 使用保护柱可以延长

6、色 谱柱寿命磷酸盐3否否当pH超过8时，降低操 作温度/缓冲盐浓度以及 使用保护柱可以延长色 谱柱寿命4-甲基吗啡啉是是通常使用浓度为10mM或更少氨水 碳酸氢 铵(HCO-)(NH4)是是通常使用浓度为510mM（用于MS工作时保持离 子源温度超过150C）。 用氨水或乙酸调节pH 值，在pH10时具有很好 的缓冲能力。乙酸铵是是通常使用浓度为110mM甲酸铵是是通常使用浓度为110mM硼酸否否降低温度，减少浓度并 使用色谱柱来延长柱寿 命CAPSO（3-环己胺基-2-羟基丙磺酸否否两性离子缓冲液，同乙 腈互溶，通常使用浓度为110m M气味小Glyci ne甘氨酸J否否两性离子缓冲液，比使 用硼酸盐对柱子的损伤 更小些1-甲基哌啶是是通常使用浓度为110mMCAPS否否两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为110m M