低温胁迫对玉米幼苗生理指标的影响资料

1、低温胁迫对玉米幼苗生理指标的影响摘要：本实验把玉米幼苗培养完成后，分别在4和常温（其它条件相同）处理24h，并测定在两种不同温度下玉米各种生理指标（叶绿素含量、植物组织水势、抗逆性、根系活力、过氧化物酶活性），分析实验结果，找出低温对玉米幼苗生长有哪些影响。对培育抗低温品种提供基础。关键词：低温胁迫，玉米幼苗，生理生化指标 植物的抗寒性分为抗冷性和抗冻性。许多喜温植物虽然不能抵抗零度以下低温的冰冻伤害, 但对零度以上低温具有一定的忍耐性, 即具有抗冷性。低温在一定程度上破坏细胞膜, 从而影响膜系统维持的生理功能。研究指出, 大部分植物在温度介于015之间时一系列生理功能被破坏。根据对低温的抗性

2、将植物分为两类: 低温敏感型, 如玉米(极限温度5)，香蕉(极限温度15)；低温非敏感型, 这类植物在015之间时受冷害的迹象不明显。另一方面, 植物对冷胁迫具有忍受力, 表现出许多从而提高低温忍受力,如可溶性蛋白、糖及游离氨基酸含量升高, 产生较多的胁迫激素ABA等。不同植物, 甚至同一植物低温适应性反应由于原产地不同, 其忍耐低温的能力不同。低温冷害是限制植物分布及农业生产的重要因素, 也是植物引种必须首先考虑的问题。研究表明, 植物的低温伤害机理首先涉及到对膜系统的破坏, 膜脂相变,从而影响膜系统维持的生理功能。黑龙江属高寒地区,玉米为低温敏感型植物，极限温度为5，是我国北方主要栽培作物

3、之一，是改善人民生活，出口外贸的重要物质之一，对发展农业、畜牧业具有十分重要的意义。因此此次研究低温胁迫对玉米的伤害有重大的实际意义。1 材料与方法 1.1材料九单571.2材料培养各选吉单57与吉单48玉米种子各700粒左右，先用蒸馏水将种子洗干净，然后将种子方放入已在底部放入湿纱布的大烧杯中，上方盖上湿纱布，放在37保温培养箱中进行催芽。将催芽成功的玉米种子摆在沙培基中，用少量沙土覆盖并用浇水，保持一定的湿度，并在温箱中培养两周。取出一部分玉米幼苗放在4的冰箱中培养24小时做低温处理，作为实验前的准备。1.3 生理指标测定1.3.1 叶绿素含量测定:分光光度计丙酮法1.3.1.1原理根据叶

4、绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿

5、素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、叶绿素b的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm处。已知在波长663nm下叶绿素a、叶绿素b在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A663nm和A645nm为叶绿素溶液在663nm和645nm处的

6、吸光度，Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。 解方程（1） （2）组得 Ca=12.72 A6632.59 A645 (3) Cb=22.88 A6454.67 A663 (4) 将Ca+Cb相加即得叶绿素总量CT CT Ca十Cb20.29A6458.05 A663 (5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：

7、 CT (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler等对Arnon进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：Ca12.21A6632.59 A646 (7) Cb=20.13 A6465.03A663 (8) Cx.c (9) 式中：Ca Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度； Cx.c为类胡萝卜素的总浓度；A663 A646 A470 分别为叶绿素提取液在波长663nm 646nm 470nm下的吸光度。由于叶绿素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。绿素a 、叶绿素b在

8、95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式；Ca13.95A6656.8A649 (10) Cb=24.96 A6497.32A665 (11) Cx.c (12)1.3.1.2材料、仪器设备及试剂1.3.1.2.1材料 新鲜（或烘干）的植物叶片。1.3.1.2.2仪器设备 分光光度计；电子顶载天平（感量0.01g）；研钵；棕色容量瓶；小漏斗；定量滤纸；吸水纸；擦境纸；滴管。1.3.1.2.3试剂：96乙醇（或80丙酮）。石英砂。碳酸钙粉。1.3.1.3实验步骤1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去

9、掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置35min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。1.3.2 根系活力测定：TTC法1.

10、3.2.1原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。1.3.2.2、材料、设备仪器及试剂材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。仪器设备：分光光度计；分析天平（感量0.1mg）；电子顶载天平（感量0.1g）；温箱；研钵；三角瓶50ml；漏斗；量筒100ml；吸量管1

11、0ml；刻度试管10ml；试管架；容量瓶10ml；药勺；试剂：乙酸乙酯（分析纯）、次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。1TTC溶液: 准确称取TTC1.0g，溶于少量水中,定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。磷酸缓冲液（115mol/L，pH7.0）。1mol/L硫酸:用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。0.4mol/L琥珀酸:称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。1.3.2.3实验步骤1.3.2.3.1定性测定 （ 1 ）配制反应液 把 1 TTC 溶液、 0.4 mol L 的琥珀酸和磷酸缓冲

12、液按 1:5:4 比例混合。 （ 2 ）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置 37 左右暗处放 1 3 h ，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。 1.3.2.3.2. 定量测定 （ 1 ） TTC 标准曲线的制作 取 0.4 TTC 溶液 0.2 mL 放入大试管中，加 9.8 mL 乙酸乙酯，再加少许 Na 2 S 2 O 4 粉末摇匀，则立即产生红色的 TTF 。此溶液浓度为每毫升含有 TTF 80 g 。分别取此溶液 0.25 mL 、 0.50 mL 、 1.00 mL 、 1.50 mL 、

13、 2.00 mL 置 10 mL 刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含 TTF 20 g 、 40 g 、 80 g 、 120 g 、 160 g 的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在 485 nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线（已有）。 （ 2 ）称取根尖样品 0.5 g ，放入小烧杯中，加入 0.4 TTC 溶液和磷酸缓冲液（ pH7.0 ）各 5 mL ，使根充分浸没在溶液内，在 37 下暗保温 1 2 h ，此后立即加入 1 mol/L 硫酸 2 mL ，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品， 37 下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。 （ 3

14、 ）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯 3 4 mL ，充分研磨，以提出 TTF 。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤 2 3 次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为 10 mL ，用分光光度计在波长 485 nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出 TTC 还原量。 1.3.3过氧化物酶活性测定：愈创木酚法1.3.3.1原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470 nm 处有最大光吸收值，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。1.3.

15、3.2实验材料：植物叶片1.3.3.3设备与试剂：电子分析天平，分光光度计，低速冷冻多管离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。（1）100mmol/L 磷酸缓冲液（pH=6.0）：0.2M的Na2HPO412.3mL和NaH2PO487.7mL混合后稀释2倍（2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19l，混合均匀，保存1.3.3.4 操作步骤1.称取植物材料1g，放入研钵中，适量液氮研磨成粉末，加适量的磷酸缓冲液于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15分

16、钟，上清液转入100ml容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于冷处备用。2.取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL（或加热煮沸5 min 的酶液），作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上在波长470nm下测量吸光度值，每隔0.5min（30S）读数一次，连续读数3次。1.3.3.5 结果计算：以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）式中：A470反应时间内吸光度的变化； W植物鲜重（g）；t反应时间（min）；VT提

17、取酶液总体积（mL）；VS测定时取用酶液体积（mL）。1.3.4组织抗逆性测定：电导率仪法1.3.4.1 测定原理和方法 植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破坏，而使其透性增大，细胞内的盐类或有机物有不同程度的渗出，从而引起组织浸泡液电导率发生变化。通过测定电导率的变化，就可以反映出质膜的破坏程度和所测材料抗逆性的大小。伤害越重，外渗越多，电导率值也就越大。1.3.4.2 结果计算 相对电导率L=（S1-S0）/（S2-S0)×100 伤害率（）=（Lt-Lck）/(1-Lck)×100 S0-蒸馏水电导率 S1-煮沸前电导率 S2-煮沸后电导率 Lt-低温处理

18、叶片的相对电导率 Lck-对照（室温）下叶片的相对电导率2 结果与分析2.1.1叶绿素含量测定:分光光度计丙酮法的结果与分析叶绿素的提取及含量测定665nm649nm叶绿素A含量叶绿素A含量叶绿素B含量叶绿素B含量室温10.452 0.154 5.246 5.262 0.5352 0.5196 室温20.453 0.153 5.267 0.5029 室温30.454 0.154 5.274 0.5206 低温10.352 0.142 3.933 3.941 0.9677 1.0137 低温20.353 0.145 3.927 1.0352 低温30.356 0.146 3.962 1.0382

19、 2.1.2根系活力测定：TTC法的结果与分析根重（g）吸光度平均还原量室温130.0248.6室温230.026室温330.028低温130.0185.2低温230.017低温330.0132.1.3过氧化物酶活性测定：愈创木酚法的结果与分析过氧化物酶含量测定0 30 60 90 过氧化物酶含量低温10.000 0.0210.040 0.058 1983 低温20.000 0.0190.038 0.060 低温30.000 0.0180.040 0.059 室温10.000 0.037 0.052 0.076 1767 室温20.000 0.032 0.047 0.061 室温30.000

20、0.037 0.052 0.075 2.1.4组织抗逆性测定：电导率仪法的结果与分析电导法测植物组织抗逆性蒸馏水电导率煮沸前电导率煮沸后电导率Lt平均值伤害率低温12.5716.5 55.5 0.2636 0.2560 14.84%低温226.4 97.0 0.2524 低温322.1 80.0 0.2522 室温116.1 123.3 0.1121 0.1264 室温217.8 102.0 0.1532 室温314.0 102.8 0.1140 2.1.5 植物水势的测定2.1.5.1 数据处理植物水势测定0.050.10.20.30.40.5常温浸泡叶片前吸光率1.3349 1.3357

21、1.3352 1.3361 1.3370 1.3371 浸泡叶片后吸光率1.3364 1.3373 1.3358 1.3358 1.3355 1.3356 折光率变化上升上升上升下降下降下降等渗浓度0.25低温浸泡叶片前吸光率1.3365 1.3376 1.3358 1.3353 1.3348 1.3356 浸泡叶片后吸光率1.33721.33831.33621.33671.33331.3327折光率变化上升上升上升上升下降下降等渗浓度0.352.1.5.2 结果分析低温处理后植物水势上升。3 讨论3.1电导率与抗冷性的关系生物膜是植物细胞及细胞器与环境的一个界面结构,各种逆境对细胞的影响首先

22、作用于生物膜,低温伤害也是如此。低温胁迫下,质膜的结构和功能受到伤害,导致细胞膜透性增大,电解质外渗,电导率增大,能够比较客观地反应植物在低温逆境中的伤害状况。本试验通过对九龙品种室温与低温胁迫后幼苗的电导率的测定,从测定结果可知随着低温胁迫时间的增加，电导率不断增加。3.2脯氨酸含量与抗冷性的关系在低温条件下,脯氨酸的积累是对低温环境的一种保护反应,脯氨酸能调节植物细胞膜的稳定性,还具有清除活性氧和稳定细胞结构的作用。冷胁迫下脯氨酸含量迅速增加,可以降低水势,作为防脱水剂来保护植物。脯氨酸的积累可能是由于蛋白质合成受阻,也可能是由于合成受激或氧化受阻,还可能是蛋白质降解的结果。在本试验中发现,从低温胁迫后,各品种幼苗的脯氨酸含量一直升高,这说明了脯氨酸与水稻抗寒性密切相关。在植物受到伤害时,脯氨酸可能是通过保护酶的空间结构,提供足够的自由水及生理活性物质对细胞起保护作用。3.3保护酶活性与抗冷性