纤维素酶的研究及应用-酶工程论文

1、纤维素酶的研究及应用摘要：我国纤维素酶的应用研究近年来取得了很大进展。本文阐述了纤维素酶的发展，菌种选育，酶的结构，反应机制以及在生活中的应用。关键词：绿色化 催化域 结合区 C1-Cx假说一、纤维素酶的发展资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物质资源是可再生性资源，地球上年光合作用的产物高达1.5×10112.0×1011t，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90%以上为木质纤维素类物质。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料

2、、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。纤维素酶的研究，自从1904年在蜗牛消化液中被发现，至今已经历三个发展阶段。第一阶段是80年代以前，主要工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化。但由于纤维素酶来源广泛、组分复杂、纯化甚为困难，故进展缓慢。第二阶段是1980年至1988年，主要工作是利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定。Trichoderma reesei的内切酶（EG、EG）和外切酶（CBH、CBH）、Cellulomonas fimi的内切酶（CenA、CenB、CenC、CenD）和外切酶（CbhA、CbhB、Cex

3、）、Clostridium thermocellum的内切酶（CelA、CelB、CelC、CelD）的基因已被克隆和测序，并在大肠杆菌，酵母菌等中得到表达。第三阶段是1988年至今，主要工作是利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分、解析、功能性氨基酸的确定、水解的双置换机制的确立，分子折叠和催化机制关系的探讨。二、纤维素酶菌种选育纤维素分解菌的筛选方法主要有纤维素选择培养基法、滤纸底物和纤维素天青培养基法、半固体纤维素天青试管法、P-N法和纤维素刚果红培养基法等。其中，纤维素刚果红培养基在对纤维素分解菌的准确识别方面具有明显的优越性。纤维

4、素是由葡萄糖残基以-1.4糖苷键连接而成的线状大分子物质，在纤维素酶的作用下水解成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类与刚果红染料形成红色沉淀，使产酶菌株的菌落周围出现清晰的红色水解圈。根据水解圈的大小，可以粗略地估计菌株产酶的情况，提高工作效率。产纤维素酶的微生物包括真菌、细菌和放线菌。其中主要的有：康氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉、芽孢杆菌等。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，而嗜碱细菌产生的纤维素酶在碱性范围起作用。三、酶的分子结构1纤维素酶分子结构域的拆分1986年Tilbeurgh1用木瓜蛋白酶有限酶切Trichoderma reesei的CBH分子得到具有独立活

5、性的两个结构域：一个是具有催化功能的催化域（catalytic domain,CD），另一个是具有结合纤维素功能的纤维素结合（吸附）区（cellulose binding domain,CBD），之后用类似的方法在多种细菌和真菌的纤维素酶中发现类似的结构。CBD在纤维素酶中位于氨基端或羧基端，它通过一段高度糖基化的linker与催化区相连。细菌纤维素酶的linker富含Pho、Thr，而真菌纤维素酶的linker富含Gly、Ser、Thr；细菌纤维素酶的CBD与 CD夹角为135°，而真菌为180°；细菌纤维素酶有两个酶切位点可将CBD与linker分别切去，而真菌纤维素酶

6、一般只有一个酶切位点可将CBD与linker一同切去。由于纤维素全酶分子呈蝌蚪状、其linker高度糖基化且具有较强柔韧性，故很难得到结晶.而结构域的拆分使呈球形催化域的结晶成为可能，为纤维素酶的结构和功能研究开辟了道路。2催化域结构和功能的研究采用X光衍射的方法1990年Rouvinen2对T.reesei的CBH的催化域、1992年Juy3对C.thermocellum的CelD的催化域、1993年Spezio4对T.fusca的E2的催化域、1994年Divne5对T.reesei的CBH的催化域进行了结晶和解析。三维结构的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作出了合理的解释：内切酶的活性位

7、点位于一个开放的cleft中，它可结合与纤维素链的任何部位并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长Loop所形成的tunnel里面，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。1995年Meinke6利用蛋白质工程的方法将C.fimi的外切酶CbhA分子的Loop删除后，发现该酶的内切酶活性果然提高，这进一步证实了上述分析。1990年Sinnott7从化学机制的角度出发论述了酶催化糖基转移的机制，他认为糖苷配基的离去是涉及到两个氨基酸残基的酸碱催化的双置换反应，这实际与溶菌酶的作用机制是相似的。1988年至1994年采用定点突变技术和酶专一性抑制剂做了大量研究812，终于证明Glu位于细菌、

8、真菌的内切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位点；在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应, 其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂13，14水解双置换机制得以证明。3 纤维素结合（吸附）区结构和功能的研究自从1986年Tilbeurgh用木瓜蛋白酶有限酶切T.reesei的CBH分子发现CBD以来，之后用类似的方法和序列缺失的方法在多种细菌、真菌的纤维素酶和半纤维素酶中发现了CBD。1995年Tomme15根据CBD分子大小及氨基酸的相似性将已知的CBD分成了10个家族，大部分的CBD位于家族、。家族的CBD包括3340个氨基酸残基，所有真菌的CBD都属于家族；家族的CBD

9、包括95108个氨基酸残基，C.fimi的CBD都属于家族；家族的CBD位于那些能产生纤维小体的梭菌中。1989年Kraulis16用核磁共振的方法对T.reesei CBH的CBD、1995年Xu17对C.fimi Cex的CBD的三维结构进行了研究；1996年Tormo18用X光衍射的方法对thermocellum的Cip的CBD三维结构进行了研究。图1为它们的结构比较：尽管它们在分子大小和折叠构型上不同（CBH的CBD是一个折叠片形成的契形结构，一面疏水、一面亲水，疏水面与底物表面接触；而后两者是2个折叠片面对面形成的一个-sandwich），但它们的吸附面是相似的，都比较平坦、暴露了几

10、个芳香族氨基酸（CBH的CBD是3个Tyr， Cex的CBD是2个Trp)及一些潜在的氢键形成残基。图1CBD的骨架结构(a)T.reesei CBH的CBD;(b)C.fimi Cex的CBD。CBD功能的研究。CBD的去除实验19表明：纤维素酶去除CBD后对可溶性底物活力影响较小，而对结晶纤维素的吸附和水解活力则有明显降低。化学突变和定点诱变20，21表明芳香族氨基酸在与结晶纤维素的吸附中发挥重要作用，它们的突变会导致CBD对结晶纤维素的吸附能力极剧下降。序列比较22表明与CBH的CBD同族的几个CBD是用Phe或Trp代替了Tyr。目前人们推测：CBD可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附

11、到纤维素上，由CBD上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下来，以利于催化区的水解作用。纤维素酶分子结构和功能的研究使其对纤维素分子链-1,4糖苷键作用的底物特异性、水解机制作出了基本阐明。但关于CBD是如何吸附到纤维素表面、吸附后CBD是如何与催化区相互作用降解纤维素的问题目前尚未作出合理解释，因为它涉及到纤维素聚合物解链、解聚等超分子结构的变化。这一问题的解决将会为有效工程菌的构建、经济利用纤维素打下基础。四、纤维素酶的反应机制纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用

12、代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作

13、用却不能将结晶纤维素水解。五、酶的应用1 在发酵工业中的应用曲音波等在对斜卧青霉发酵过程研究的基础上，结合抗性菌株的选育成功地用亚铵纸厂废液、废渣生产纤维素酶。他们选用一株抗黑液抑制物的斜卧青霉J UA10，以亚铵法制浆的蒸煮废液（黑液）和3%的细小纤维作培养基，采用双阶段变温培养（生长温度34，产酶温度28）等措施，发酵生产纤维素酶。在50L发酵罐中进行的全废料培养基产酶实验显示，接种48h后酶活可达4.61 IU/ml，发酵周期较短，酶产率达100IU/(L·h)，单位底物的酶得率达264IU/g纤维素。通过使用补料分批技术，在48h后向发酵罐中间歇补入少量细杂纤维，可使酶活进一

14、步提高到7.2 IU/ml，但发酵周期延长。从开辟新能源和解决环境污染考虑，以废纤维为原料生产酒精日益受到重视。造纸厂制浆过程中筛除的细杂纤维已经过了机械粉碎和化学预处理，脱去了部分木素，纤维素含量达60%70%，容易被酶解发酵，适宜作为酒精发酵的原料。20世纪80年代末期采用同时酶解发酵和补料技术，使细杂纤维的纤维素酒精转化率达到65%，发酵液酒精浓度达4%。后采用全废料培养基并补加少量由曲霉菌株产生的高-4葡萄糖苷酶活的粗酶液后，可使纤维素的酒精转化率达70%，原料酒精得率20%，酒精浓度5%以上，可为发酵工业所接受。利用备料废渣配制培养基固态发酵生产纤维素酶曲，进而酶解细杂纤维发酵生产酒

15、精的研究结果显示，通过采用纤维素酶高产菌和-葡萄糖苷酶高产菌的混合培养，或经过培养基和培养条件优化，都可以人为地控制纤维素酶曲的酶系组成，使纤维素的酒精转化率达到50%以上。采用纤维素淀粉共发酵技术，即在纤维废渣中添加一定量的玉米面，可使酒精产量大幅度提高，达到了工业化生产的要求。随着啤酒生产的快速增长，啤酒糟对环境的污染日益加剧。目前，啤酒糟大多作低价饲料和肥料直接出售，销量有限。因其含水量高，不能久贮，易霉烂，从而造成资源浪费。利用纤维素酶水解啤酒糟将酶解液和残渣分别进行有效利用，可大大提高啤酒糟的经济和环境效益。梁如玉等利用里斯木霉产生的纤维素酶水解经硫酸和高温、高压预处理过的啤酒糟，在

16、适宜条件下，100g干啤酒糟可水解得10.8g还原糖，酶解液用于培养酵母菌提取麦角固醇，残渣是生产菌体蛋白饲料的原料。2 在洗涤剂工业中的应用以木霉、曲霉属等真菌产生的酸性纤维素酶主要是将木质纤维素转化成葡萄糖。近年来，碱性纤维素酶在洗涤剂工业上的应用改变了传统的去污机制。碱性纤维素酶与酸性纤维素酶对底物的作用不同。酸性纤维素酶对木质纤维素的作用是一个糖化过程，在多种组分的协同作用下能得到更多的最终产物葡萄糖；而碱性纤维素酶是一种非全组分的内切葡萄糖苷酶，主要与棉纤维中仅占10%左右的非结晶区的纤维素分子起作用。棉纤维吸水性好，但污垢侵入后与水分子结合形成胶状物而被封闭在纤维素分子结构中，一般

17、洗涤剂不易洗出，而碱性纤维素酶可选择性地吸附在棉纤维的非结晶区，使棉纤维膨松，水合纤维素分解，胶状污垢脱落。所以，碱性的作用对象是棉纤维而不是污垢。宋桂经等分离一株芽孢杆菌074，经过Sephadex G-100，DEAE-sephadex A-25和Agaorsc 4B三种方法分离纯化后，得到一个单组分碱性纤维素酶，其最适反应温度为50，最适反应pH78，不能分解天然纤维素，CMC对酶的合成无诱导作用。这给工业化生产中的发酵和后处理工艺带来极大方便，酶活较稳定，添加于洗涤剂中并不明显降低棉纤维的牢固度，经国家有关部门测试，完全符合国家洗涤剂用酶标准。3 在纺织工业上的应用纺织品的天然纤维素纤

18、维结构复杂，结晶度高，利用纤维素酶对纤维素纤维织物进行生物整理后，可使纺织物膨松、柔软、表面光滑，毛羽、棉结明显地被清除，织物光泽和色泽鲜艳度明显改善。中国科学院微生物研究所的崔福绵等从生霉棉布上分离出一株产纤维素酶复合物较高的菌株，可用于棉、麻布的抛光处理和牛仔服“石磨”处理，使表面伸出的小纤维末端被除去，有效地减少了织物的起毛和起球，能获得持久的柔软度和光滑度，牛仔服用酶水洗比浮石处理损伤要小，且不要额外的柔软剂，有利于保护环境，使加工服装的质量优良。随着研究工作的不断深入，纤维素酶的研究越来越深入，应用也越来越广。参考文献1Tilbeurgh H,Tomme P,Claeyssens M

19、, et al. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase from T.reesei. FEBS Lett, 1986,204(2):2232272Rouvinen J, Bergfors T, Teeri T. Three-dimisional structure of cellobiohydrolase from T,reesei.Science,1990,249(4967):3803863Juy M,AmitA G, Alzari P M, et al.Crystal structure of a thermostable bacteri

20、al cellulose degradingenzyme. Nature,1992,357(6373):89914Spezio M, Wilson D B, Karplus P A. Crystal structure of the catalytic domain of a thermophilicendocellulase. Biochemistry, 1993,32(38):990699165Divne C, Stahlberg J, Reinikainen T, et al. The three-dimensional crystal structure of the catalyti

21、c coreof cellobiohydrolase from Trichoderma reesei. Science,1994,265(5171):5245286Meinke A,Damude H G, Tomme P, et al. Enhancement of the endo-beta-1,4-glucanase activity of anexocellobiohydrolase by deletion of a surface loop. J Bio Chem,1995,270(9):438343867Sinnott M L. Catalytic mechanism of enzy

22、matic glycosyl transfers.Chem Rev, 1990,90(12):117111928Mitsuishi Y, Nitisinprasert S, Saloheimo M, et al. Site-directe mutagenesis of the putative catalyticresidure of T.reesei. FEBS Lett,1990,275(1):1351389Macarron R, Beeumen J, Henrissat B, et al. Identification of an essential Glutamate residure

23、 in the activesite of endoglucanase . FEBS Lett,1993,316(2):13714010Trimbur D E, Warren R A, Withers S G. Region-directed mutagenesis of residues surrounding the activesite nucleophile in beta-glucosidase from Agrobacterium faecalis. J Biol Chem, 1992,267(15):102481025111Tull D, Withers S G, Gilkes

24、N R, et al. Glutamic acid 274 is thenucleophile in the active site of a retainingexoglucanase. J Biol Chem,1991,266(24):156211562512Wang Q, Tull D, Meinke A, et al. Glu280 is the nucleophile in the active site of Clostridiumthermocellum CelC, a family A endo-beta-1,4-glucanase. J Biol Chem, 1993,268

25、(19):1409614010213Tomme P, Warren R A, Gilkes N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi. Adv Microb Physiol,1995，37(1):18114Kraulis P J, Jones T A. Determination of three-dimensional protein structures from nuclear magneticresonance data using fragments of known structures. Proteins, 1987,2(1)

26、:18820115Xu G Y, Ong E, Gilkes N, et al. Solution structure of a cellulose-binding domain from Cellulomonas fimiby nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry, 1995,34(21):6993700916Tormo J, Lamed R, Chirino A J, et al. Crystal structure of a bacterial family- cellulose-bindingdomain: a ge

27、neral mechanism for attachment to cellulose. EMBO J, 1996,15(21):5739575117Gilkes N R, Warren R A J, Miller R C, et al. Precise excision of the cellulose binding domains from twoCellulomonas fimi cellulases by a homologous protease and the effect on catalysis. J Biol Chem, 1988, 263(21):104011040718Linder M, Mattine M L, Kontteli M, et al. Identification of functionally important amino aci