重庆永川区卫星湖水库水体细菌多样性调查

1、重庆永川区卫星湖水库水体细菌多样性调查（第二小组 廖敏鹏 刘兴 魏淑婷）1.卫星湖水库自然环境情况的介绍重庆市永川区属于亚热带季风性湿润气候，平均气温18.2 ，最高气温39 ，最低气温2 。年平均降雨量1042.2 mm，平均日照1298.5 h，年平均无霜期317 d。卫星湖全长8公里，水面1500亩，最大水深15 m，库容999×104m3湖湾交错，有自然形成的多个半岛和全岛。湖西北岸为全国农业旅游示范区、省级森林公园黄瓜山和著名的比子沟风景区，湖东南岸为金三维生态花卉园区。在2000年卫星湖永川区政府列为永川市民的饮用水源之一，因此明确卫星湖水库中细菌的多样性就显得尤为重要。

2、2.材料2.1 实验试剂提取缓冲液：200mM NaPO4, 120mM异硫氰酸胍，2%PVP-k30.150mM氯化钠, 2%SDS, 0.5MTris腐植酸去除剂：100mM 十二水硫酸铝铵DNA结合液：4.5M 异硫氰酸胍 ，0.5M 醋酸钾 (pH 5.2)，溴酚红少许膜洗涤液：50 mM Tris-cl，0.1mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脱液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超纯水（无DNA酶）  pH8.0 5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml 5×TBE：Tri

3、s 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）凝胶加样缓冲液（6×）溴酚蓝 0.25%蔗糖 40% 琼脂糖 溴化乙锭溶液（EB） 0.5g/ml Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer,25mmol/lMgcl2,0.225mmol/ldNTP, 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul）DNA结合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚红少许膜洗涤液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脱液：2.5mM Tris-

4、HCl(pH8.5)或超纯水（无DNA酶）  pH8.0 尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖PCR扩增相关试剂2.2 实验器材5ml离心管，1.5ml离心管，枪头，硅胶膜纯化柱。1.6um、0.22um 滤膜，真空抽滤装置。琼脂糖凝胶电泳系统 ，凝胶成像系统或紫外投射仪，PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪，高速台式离心机 、微量取液器；1.5，0.5和0.2ul的EP管、水浴锅，电子秤、切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶P,变性梯度凝胶电泳仪,凝胶成像及分析系,高速离心机,电泳槽。实验步骤3.1基因组总DNA的提取3.1.1水体样品采集根据河流湖泊采样规则，实

5、地勘察卫星湖周边的环境设施，在卫星湖周边区域设定了10个采样点（具体采样点的分布见图1，学校一侧5个，对岸5个），每个水样采集1升，记录采样地环境参数（位置GPS经纬度，温度，周围环境描述）。水体样品采用1.6um孔径的滤膜真空滤除悬浮物和真核微生物，再利用0.22um孔径的聚碳酸酯膜收集微生物细胞。 取下过滤装置漏斗部分，使用两只灭菌镊子从边缘夹起滤膜，滤膜上面朝内卷成圆筒状。放入5ml离心管中-20保存备用。图一. 取样位置图3.1.2微生物基因组DNA提取.在5ml样品管中加入1 ml提取缓冲液。 注意：提取缓冲液使用前必须先预热溶解沉淀并趁热使用。若样品中含有难裂解微生物，可额外56水

6、浴10min。【去垢剂可破坏细胞壁，去除非DNA的有机、无机成分】.把5ml离心管放入涡旋研磨仪适配器中，最大转速涡旋振荡5min。 【涡旋振荡的机械作用力在打碎滤膜表面沉积物释放出截留细胞的同时辅助裂解细胞】.室温4000g离心2 min。 .使用1ml枪头深入到底部吸取上清，并转移600ul上清到一个干净的1.5ml 离心管中。.加入0.4倍体积的乙酸铵，混匀，冰上放置10min。【移除腐植酸、细胞碎片、蛋白等非DNA 的有机、无机成分】 13000g离心1min。 避开沉淀转移上清到一个干净的2ml管中。 .加入等体积的DNA结合液，混匀。 【DNA 在高盐条件下将选择性地吸附到离心柱硅

7、胶滤膜上 】.加载650l上清到一个离心柱硅胶滤膜中，13000g离心1min。弃去滤液重复上述步骤直到过滤完所有上清。 注意：通常需要加样两次。 .加入650l膜洗涤液到滤膜中，13000g离心1min。 去掉滤液。重复1次。【膜洗涤液为含酒精冲洗液，用于冲洗离心柱滤膜，去除残留的盐分等杂质】.把离心柱硅胶滤膜放到一个干净的1.5ml 离心管中。 .加入100l洗脱液到离心柱白色滤膜中心。 【DNA在无盐条件下选择性地洗脱下来】 .13000g离心1min。 .弃去离心柱。DNA（-20-80）保存。3.2.DNA的琼脂糖凝胶电泳检测3.2.1制备琼脂糖凝胶.按照被分离DNA的大小，决定凝胶

8、中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb0.3 5600.6 1200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13.称取0.24g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入80ml 0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为0.8%琼脂糖凝胶液，加入1.5l的EB。3.2.2.胶板的制备.取有机玻璃内槽，洗净，晾干。.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。.将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 .待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏

9、，放在电泳槽内。.加入电泳缓冲液至电泳槽中。3.2.3.加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（上次实验的质粒DNA和基因组DNA）加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。 3.2.4.电泳.接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的.迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。.凝胶图像分析系统拍照观察3.3.聚合酶链式反应（PCR）技术.在50 ul反应体系中分别加入：MiniQ H2O37.5ul10×PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1

10、ul引物1(10M) 1ul引物2(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（cDNA） 1ul终体积为50 ul （此处我忘记了总体积和各个配样的体积，你们改一下）注意：如果只是普通的检测，而无须回收时，则25ul的反应体系即可（上述体系中的各成分相应减半）.短暂离心混匀后，放入PCR仪中，反应程序如下：I） 943-5minII） 94 1min581min 721min30sec 30-35个循环 III） 72 7-10minIV） 4 保存.反应完成后，将PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果.将目的条带（16s核糖体DNA片段）从琼

11、脂糖凝胶上切下，放入1.5ml离心管中，称取重量后于-20保存。3.4. DNA的琼脂糖凝胶回收 .按照标准的方法进行DNA电泳，请使用质量好的高熔点琼脂糖，或低熔点琼脂糖，使用TAE或TBE为电泳缓冲液。. 取与样本数相同的若干1.5ml离心管，分别称量后记录下重量。. 使用插入染料如溴化乙锭对DNA进行染色。在较长波长紫外灯下，用干净的手术刀片或刮胡刀片切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶块，尽量减小胶块的体积。为防止DNA 损伤，要尽量缩短DNA暴露在紫外灯下的时间。将胶切片转入已称重的离心管中，再称重后减去空管的重量，得到胶切片的重量。注意：胶切片可在4或-20于无RNA 酶的离心管中储存一

12、周，请务必盖紧管盖。.按照每10mg胶切片加10ul结合液的比率加足量膜结合液。.振荡混合以上混合物，在50-65下孵育10分钟，或直到胶块完全融解。每隔几分钟振荡离心管以加速胶块的融解。室温短暂离心，使溶液集中于管底。【溶液颜色应为黄色(pH<7)，如为红色(pH>8)，加入10ul 3M 醋酸钠（pH5.0)调节为黄色】.将溶液加入硅胶模离心柱中，室温放置5ml。.14000g离心2分钟。 .加入700ul洗涤液，室温放置5min,14000g离心2分钟。.重复步骤6一次。.室温干燥2分钟，加入50ul预热的洗脱液，室温放置5min,14000g离心2分钟。弃硅胶膜离心柱。.检

13、测回收DNA的吸光度，计算其含量和纯度3.5.DGGE检测微生物多样性3.5.1.DGGE分析样品的制备PCR反应（同前）1）在50 ul反应体系中分别加入：MiniQ H2O28.5ul10×PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1ul引物1(10M) 1ul引物2(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（回收DNA） 10ul终体积为50 ul 其中，引物为357F-GC和518R，退火温度为55，延伸时间30s，循环数34。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。点样1ul，片段大小为200bp。3.5.2.垂直变性梯度凝胶电泳分析变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向平行。所使用的胶为9%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为36%-54%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。PCR产物加上样缓冲液后，