氯苯类化合物废水处理

1、)找污水处理技术，上中国污水处理工程网氯苯类化合物1引言氯苯类化合物作为农药及染料合成中间体、清洗溶剂及脱脂剂成分广泛使用自然界微生物缺乏降解此类化合物的酶或酶系统，很难进行生物处理，微生物降解菌的筛选和降解性能研究是 实现生物降解持久性有机污染物的关键.1，2，3，4-TeCB在GB 6944 2005中危险标记为14（有毒物品），是一种典型的氯苯类化合物，对人体的皮肤、上呼吸道和粘膜有刺激作用，可在人体 内积累.目前四氯苯的研究主要围绕其物理特性和毒性.四氯苯的晶体结构和混合晶体结构，在水和空气之间的传质作用，沉积物和悬浮物对1，2，3，4-TeCB的吸附作用，1，2，3，4-TeCB对孕

2、鼠肝和生殖率影响等均有广泛研究.对于低分子氯苯类化合物及首先被限制使用的六氯苯微生 物降解已有一些报道.但关于TeCBs的微生物降解研究却鲜有报道.研究发现，五氯苯、六氯苯在降解过程中往往存在1，2, 3，4-TeCB中间产物，这表明1，2，3，4-TeCB的降解是高氯苯化合物降解的关键步骤.本文从某氯苯试剂厂的土壤中取样，筛选出一株以1，2，3，4-TeCB作为唯一碳源的降解菌，并研究了该菌株对1，2，3，4-TeCB降解效果及降解途径，为微生物降解氯苯类物质提供实验依据.2材料和方法2.1原料与试剂所用土样取自广东某化学试剂厂长期受四氯苯污染的土壤作为菌株分离源化学试剂：1，2，3，4-T

3、eCB、丙酮、正己烷等试剂均为优级纯.培养基：常规牛肉膏蛋白胨;无机盐培养基（组分不含Cl-）均为常规配方（试剂均为分析纯）2.2主要实验仪器生化培养箱；恒温水浴振荡器；超净工作台；高速离心机；COD消解仪；离子色谱仪；高效液相色 谱；气相色谱-质谱联用仪.2.3菌种富集和分离纯化取1 g 土壤于100 mL蒸馏水 中，摇床振荡15 min，样品稀释后直接涂布在100 mg L -11，2，3，4-TeCB的无机盐培养基.待长出菌落后，挑取单菌落在高浓度（250 mg L-1）1，2，3,4-TeCB的液体培养基驯化.经过57 d驯化后（定期更换培养液），取12 mL菌液涂布于1，2，3， 4

4、-TeCB为唯一碳源的无机盐平板，30 C恒温培养，挑选生长较快的单菌落接种到100 mg L -1 1，2，3，4-TeCB液体无机盐培养基中振荡培养；多次平板划线分离，获得单菌落.2.4菌株形态观察、生长曲线及16S rDNA序列分析)找污水处理技术，上中国污水处理工程网将纯化后的菌株在固体培养基上进行划线培养，待长出单个菌落后进行形态观察；对菌株进行革兰氏染色观察；用OD600处测定生长曲线.PCR产物经凝胶电泳分析检测后将 PCR产物送至广 州工业微生物检测中心回收并测序2.5菌株对1， 2， 3， 4-四氯苯降解效果的研究实验所用废水为 25 mg L -1 1，2，3，4-TeCB

5、模拟废水，pH 7.取200 mL无机盐培养基置于 500 mL锥形瓶中，经高温灭菌后，配置成 25 mg L -1的模 拟废水，分别加入 2% 3% 5%勺菌悬液.30 °C，110 r min -1.接种后每天定时取样分别测定 模拟培养液中 COD Cl-浓度、1，2，3，4-TeCB浓度的影响，连续测定 7 d.每组3个平行.1）COD测定：快速消解分光光度法 .2）氯离子浓度测定：样品测定前，样品经过0.22卩m微孔过滤膜，用离子色谱仪测定氯离子浓度.3）1，2，3，4-TeCB浓度测定：用高效液相测定.前处理：废水经 0.22卩m微孔过滤膜过滤,测定过滤液中1，2，3，4-

6、TeCB.测定条件：TH 1015型C18酸性柱；流动相为甲醇与水按 85:15 体积比混合；柱温25 C ;进样体积10卩L;双波长检测：波长为 214 nm、216 nm.2.6降解特性分析不同处理时间的废水经 0.22卩m微孔过滤膜过滤，吹扫捕集后，利用气相质谱联用仪（GC-MS）测定氯苯降解情况及产物分析.吹扫捕集条件：吹脱时间：11 min;吹脱温度：350 C ;解析温度：225 C ;解析时间：6 min;烘烤温度：235 C ;烘烤时间：5 min.注入样品5 mL.色谱条件： 检测器温度：300 C ;进样口温度：260 C ;柱箱温度：起始 60 C，保持2分钟，以5 C

7、min-1的速度升温至 160 C，保持 2 min.分流比：10 : 1.3结果与分析3.1菌株生理生化特性、16S rDNA序列分析及生长曲线以1，2，3, 4-TeCB为唯一碳源富集、分离、驯化微生物，筛选出一株在固体培养基上能快 速生长的菌株，命名为 L-1号菌.菌落表面圆滑，不透明，呈白色或微黄色.菌株为短杆状，无鞭毛，能运动，能产生中生芽孢.菌株革兰氏染色结果为阳性菌（G+），如图1所示.在此基础上，对L-1号菌的16SrDNA基因系列运用 Basics BLAST软件分析，和 Genbank比对，L-1菌ITS序列与 Bacillus subtilis AF0907（枯草芽孢杆菌

8、）和 Bacillus carboniphilus JCM9731具有最高的同源性，均达到98.5%以上 .结合生理生化特性，初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌.为了解菌株生长特点，对L-1号菌进行生长曲线的测定，见图2.)找污水处理技术，上中国污水处理工程网图1菌株L-1的菌落形态和革兰氏染色101520253035I I)找污水处理技术，上中国污水处理工程网)找污水处理技术，上中国污水处理工程网图2菌株L-1的生长曲线从图2中可见该菌株在 03 h生长较慢,5h后迅速进入生长期，表明该菌株潜伏期较短能)找污水处理技术，上中国污水处理工程网)找污水处理技术，上中国污水处理工程网够快速适应生长环境，

9、进入对数生长期.1234 h该菌株生长减慢，进入稳定期，直到30 h后该菌株一直处于稳定期，表明该菌株生长代谢稳定期长，降解潜能较大，利于工业应用.在菌株培养了 15 h后，菌的浓度能达到约108 cfu.为实验用菌提供保证.3.2不同接种量对反应液COD勺影响将菌株制成菌悬液（108 cfu），测定不同接种量对25 mg L-1模拟废水CO降解效果，初步反映菌液中有机污染物的量，结果见图3.国污水处理工程网()找污水处理技术，上中国污水处理工程网55%5(r<>15%节 -30% -234567叶间图3接种量对废水 COD累积降解率的影响从图3可见，随着时间增长，反应液COD累积

10、降解率逐渐增大，接种浓度越大降解率越高.7d后降解率分别达到：32.61%;53.79%;62.71%.在第12 d时，菌株生长处于对数期，降解效果好， 反应液COD降解较快.在第3 d后水中COD累积降解率稳步增加，菌株生长趋于稳定.37 d COD累积降解率斜率基本一致，表明单位时间菌体的降解效率稳定.与图2中菌株生长曲线相对应.说明L-1菌株生长代谢稳定强，能充分利用废水中的有机物.说明该菌株并不能迅速的将1, 2, 3，4-TeCB完全矿化.在5 d后COD降解率逐渐减缓，但能保持一定的降解效果3.3不同接种量对氯离子释放量的影响在配制模拟废水时，无机盐培养基中不含Cl-，反应液中的氯

11、离子含量多少反映了降解过程中对1，2，3，4-TeCB的降解脱氯过程，结果见图4.国污水处理工程网()找污水处理技术，上中国污水处理工程网3.01.0050-05T- ?時捲种虽 十埶接种量 亠5%接种戢2.52 04吋间旬图4接种量对氯离子释放浓度的影响从图4可以看出氯离子释放浓度趋势与COD降解呈一定的相关性.在14 d，氯离子随菌浓度增大，氯离子释放量浓度增大这表明菌株在1，2，3, 4-TeCB降解的过程中确实有 Cl-产生.且接种量越大，氯离子的释放越多但在5d后氯离子释放量，再次呈现快速增长，表明该菌有可能使1，2，3, 4-TeCB释放多个氯离子，可能使三氯或者二氯化合物脱氯因此

12、氯离子浓度的变换呈现二次增长趋势不同接种量反应液中的氯离子浓度在7 d时的含量分别为：1.852mg L -1，2.742 mg L -1，4.980 mg L -1.3.4不同接种量对1，2，3，4-TeCB的降解量从图5中可以看出，1，2，3，4-TeCB的降解量随着时间的增加而增大，呈现一定的时间-效应关系，且菌株接种量大降解率高.2%、3% 5浓种量7 d后降解量可达13.74 mg L -1，14.91 mg L -1，20.47 mg L -1.第14 d，尽管微生物量增多，但是菌株降解速率较慢，这 可能与菌株尚没有合成降解1，2，3，4-TeCB相应的酶有关.第46 d，1，2，

13、3，4-TeCB的降解量逐渐加大.表明菌株逐渐适应新的胁迫环境.到7 d降解量变化不大，表明菌株生长所需有机物逐渐减少，降解效果也随着下降 .该结果与COD量变化不同，菌株 COD在第7 d时最高只降解62% 这表明该菌株能利用1，2，3，4-TeCB，但对1，2，3，4-TeCB的完全矿化需要一个过程，该结果正好与氯离子的二次释放相吻合.FlGLIEhM量20161412105642At0-674时间匍图5不同接种量对1, 2, 3, 4-TeCB降解量3.5加标回收率与RSD和GC-M护物分析进一步分析L-1菌株对1，2，3，4-TeCB的降解产物的特性，样品的加标回收率见表2.仪器瀏也程

14、可决茶数加毎回收率RSDCOD消解枚 r=54S7.0x+1O.156 09964,2?%离子色谐仪 y=0 J1814j+0.u2l：2 0.9?971JD041 5Q5%高皴液粕色鲁 6021Dx0.99S497 80%3 96%注;滋检测弦度ng丄S朋加标浓度mg丄气表2样品的加标回收率与RSD通过对反应液 GC-MS测定和分析，发现 1，2，3，4-TeCB降解过程中存在：2，3，4，5-四 氯-2，4-己二烯二酸（A物质）和2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-内酯-己酸（B物质）.图6（a、b） 分别是A、B物质的质谱图.国污水处理工程网()找污水处理技术，上中国污水处理工程网1

15、0027150Cl人严OOHCl24FL%100143153 |7 丄11" J疳150200mix"1卡料1250_1300b B物质图6A、 B物质的相对丰度通过对废水pH的测定，反应液从 pH 7降低到pH 5.3，说明最终产物中生成了酸性物质.通过对产物的分析，推测 径分析如图71，2,3，4-TeCB降解途径是先通过开环后脱氯的途径.通过对其降解途所示.C1CICIC1CIH C1 O HC1C1OHOH C1CIC1HC1 <OOH +1AA 父 OOH0 oC1CIC1CC1C1COO11HOOCO COOH国污水处理工程网()找污水处理技术，上中国污水

16、处理工程网国污水处理工程网()找污水处理技术，上中国污水处理工程网HCi HCIC1HOOC* TCA cycly国污水处理工程网()找污水处理技术，上中国污水处理工程网COOH图7菌株L-1对1，2，3，4-TeCB的降解途径1，2，3，4-TeCB在加氢氧化酶的作用下产生环双氧化，生成环氯代二醇，然后在脱氢酶的作用下脱去两个氢原子生成3, 4，5，6-四氯邻苯二酚；再经过氧化开环生成 2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸，并在相关酶的作用下发生内酯化脱去氯离子生成2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-内酯-己酸，之后通过水解酶生成 2，3，5-二氯-4-氧代-2-烯己二酸，这种化合物

17、能在 NADH作用)找污水处理技术，上中国污水处理工程网下打开双键同时脱氯，形成饱和脂肪酸，最后生成琥珀酸和乙酸，最终进入TCA循环.该中间化合物大部分在反应液中检测出来，证实了该降解途径的可行性及该菌种研究的潜在价值.关于菌株L-1的其他生理生化特性及菌种鉴定值得进一步深入研究。4结论1）从广东某化学试剂厂周边土壤筛选出一株能降解1，2，3，4-TeCB的菌株L-1，该菌株为短杆状，能产生芽胞的革兰氏阳性菌，经16S rDNA鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌2）菌株L-1不同接种量对模拟废水（25 mg L -1）的最佳处理效果：C0D降解率达62.71%， 氯离子浓度达 4.980 mg L -1;1，2，3，4-TeCB 降解量高达 20.47 mg L -1.3）废水的COD降解率随接种量增大