全长cDNA在功能基因组学中的意义

1、全长cDNA在功能基因组学中的意义cDNA (complementary DNA )是指从 mRNA 反转录而得到的 DNA ,是 mRNA 的一个可靠的拷贝。 由于cDNA已经经过了剪接，而且含有完整的CDS,因此cDNA是研究基因功能以及基因结构的重要资源。采用一般的方法构建的cDNA文库，其全长的比例往往比较低，主要是因为在cDNA第一链的生成过程中，反转录酶在还没有生成完整的第一链的情况下就脱离了反应，以致得到不完整的 cDNA o CDNA第一链的生成一般使用 polyT作引物，因此，一般 cDNA文库中，含有大量的 3'端 EST,而mRNA5 '端的信息较少。但在

2、功能基因组的研究中，5'端序列更有意义。因此，构建富含全长的cDNA克隆的文库显得更加重要。1富含全长cDNA勺文库的构建全长cDNA就是含有完整的 3'和5'端白cDNA ,mRNA的3'端具有polyA作为“标签序列"(sequence tag)用于辩别mRNA或cDNA是否含有完整的3'端。在生成第一链cDNA的过程中一般采用 polyT 作引物，所以，得到的 cDNA克隆一般都含有完整的 3'端。mRNA的5'端与3'端不同，它没有 高度保守的序列可用作“标签序列”来通过 DNA/DNA 或DNA/RNA 杂交进

3、行5'端鉴定，只有帽 子结构(CAP)。因此为了分离到全长 cDNA克隆，研究者一般利用“帽子结构”在 mRNA的5' 端加上一段序列或者其他标记物。1.1.1常规方法这里说的常规方法，也就是够建一般的 cDNA文库所采用的方法。分离出 mRNA后，以mRNA为 模板、带接头的polyT作引物合成第一链 cDNA ,再以用第一链作模板合成双链 cDNA ,加上5'端 接头，便可连到载体上。1.1. 2 Oligo CAP勺方法Oligo-CAP的方法是在 mRNA的5'端加上一段寡核甘酸取代5' CAP。具体过程如图1所示。其原理是在 BAP (bact

4、erial alkaline phosphatase)和 TAP ttobacco acid pyrophosphatase)的作用下，完 整的mRNA (含CAP)的5'端的G被切除，剩下一个一个磷酸基团，可以在 RNA连接酶的作用 下与Oligo adapter连接；而不含 CAP的mRNA的5'端则是一个羟基，无法与 Oligo adapter连接。 这样，mRNA的5'端也有了可识别的“标签序列”。1.1. 3 CA- Select 的方法如图2所示，在生成cDNA第一链时，引物中带锚定序列，同时加入 MnCl2。在MnCl2存在时，反 转录酶会在有 CAP的m

5、RNA为模板的第一链 cDNA的3'端加上三至四个 dCMP ,然后在末端转 移酶的作用下加上三到四个 dAMP ,在3'端形成一粘端。这样，在 RNA连接酶的作用下加上 3' 接头。这样，在 5'和3'端都有特异白序列用于 PCR扩增及全长cDNA的筛选。1.1.4 CAP Traper select的方法Zy iA；rM Tg上 MI I-riawPdEK W”Adifiiir lifflua口*，二炉%打'心内：1 "7.： 田 &i iiUh,.LfewmirtiE- nJ.-k-MJiiil TImAh髀刎HJffAI

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8、lccc (c2. J.rifl I ：., 'f' I ： I i nlzi A 1 ! - 31 f'：.rlAAA (A)CCC(C>3. Selective libation of ful1 length cdnaaaa(a)ccc(c>1. IJCE? imp I i f icctL ionadapter primerunch'irriraier图2 CAP SELECT法获得全长 cDNA要过程如图3所示。它采用的策略就是 cDNA第一链生成，DNA/RNA复合物未分离时，用生物素 标记RNA的5'端，再用 Rnase I处理。如果形成的第一链 cDNA不完整，那在 Rnase I的作用下， 突出的单链RNA被降解，5'端的生物素标记也随之失去。生物素与磁珠偶联的亲和素吸附，这样， 经过层析，便可把全长与非全长的cDNA分离开。1 . 2文库中全长cDNA的识别以上介绍的几种方法可得到含有一定比例全长cDNA的文库。但并非所有的克隆都是全长cDNA克隆，因此还