一个ALS家系突变SOD1的表达及其空间构象的分析

1、一个ALS家系突变SOD1的表达及其空间构象的分析 作者：胡俊 吴亚光 王峰超 李露斯 陈康宁 史树贵 【摘要】 目的：对一个肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)家系的突变铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1)基因进行研究，了解其与野生型SOD1在不同部位神经组织中表达的差异性。采用软件进行模建，对突变SOD1蛋白质的二、三级结构进行预测和分析。方法：采用Northern杂交对突变SOD1 mRNA进行分析;克隆出突变SOD1 cDNA和野生型SOD1 cDNA，采用含有人多种神经组织mRNA的预

2、制Northern杂交膜，了解突变SOD1与野生型SOD1在不同部位神经组织中表达的差异性;采用软件对突变蛋白质的二、三级结构进行模建分析。结果：Northern blot分析证实2号外显子mRNA缩短。野生型和突变的SOD1基因具有相似的组织表达差异性，在大脑皮层表达最高，在脊髓表达最弱。突变后的SOD1蛋白质二级、三级结构与野生型SOD1基本相似。结论：突变后SOD1酶活性的功能下降可能是引起该家系发病的原因，SOD1基因在不同神经组织表达的差异性，可能是该家系ALS患者临床表现以下运动神经元损害为主的原因。 【关键词】 肌萎缩侧索硬化症;铜锌超氧化物歧化酶;表达;空间构象1 / 18我们

3、在重庆地区发现一个常染色体显性遗传的肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)大家系1，该家系临床表型与目前文献报道的FALS家系临床表型有差异，表现为：(1)以下运动神经元损害为主要临床表现，有明显的前角细胞刺激症状，躯干及四肢肌肉明显萎缩，以肢体末端肌肉萎缩最显著，后期手足畸形呈“爪形手”、“弓形足”;(2)上运动神经元损害轻微，在8例存活的患者中，仅2例腱反射活跃或亢进，1例病理反射阳性，另1例病理反射可疑阳性。我们对该家系成员的铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1)基因的5个外显子进行突变位点的

4、筛查，发现部分家系成员的2号外显子插入了一个碱基A，我们认为这一新的SOD1突变类型可能是引起该家系发病的主要原因1，2。我们对这一新的突变SOD1进行研究，了解其与野生型SOD1在结构上以及不同部位神经组织中表达的差异性，并采用软件分析其二级、三级空间结构，为进一步研究该家系的发病机制提供理论基础。1材料和方法1.1 材料：家系成员(见图1)外周血标本，TriPure Isolation Reagents购自美国Roche公司。PCR产物纯化试剂盒购自上海华禹生物工程公司。RNA酶抑制剂、反转录酶AMV及缓冲液、Oligo DT购自Promega公司。Lambda DNA/Hind mark

5、ers、PCR markers购自华美生物工程公司。DL2000 Ladder Marker购自北京天为时代科技有限公司。BD2000 Ladder Marker购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。32P标记的dCTP试剂盒购自北京福瑞公司。PCR引物由上海博亚公司合成。图1 该ALS家系图谱1.2 实验方法1.2.1 家系成员Northern杂交(1)外周血总RNA抽提：分别抽取家系成员：5、12、11 、9、7、20、1、5、4、11 、3 、2、2、6、13 静脉血5ml，采用TriPure Isolation Reagents总RNA提取试剂盒提供的方法提取外周血白细胞总RNA。

6、(2)标记探针：采用随机寡核苷酸引物合成DNA探针，在一个PCR反应管中加入待标记片断1l(约200ng)和随机引物11l(约75ng)，置沸水中煮3min后放入冰水冷却;加5单位(约1l)的大肠杆菌聚合酶IKlenow片段，室温下温浴至少3h。(3)RNA电泳：制备凝胶和样品，随后将样品加至凝胶加样孔，将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，3-4V/cm电压降进行电泳，溴酚蓝迁移出约8cm结束电泳。(4)转膜：按Southern blot转膜方法进行转膜，室温真空中保存。(5)杂交：用杂交溶液于42进行预杂交，时间12h。在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，在适宜的温度下继续温育1

7、624h。(6)信号检测：室温洗膜20min，随后68洗膜3次，每次20min;用X光片(Kodak)进行放射自显影，附加增感屏， -70曝光24-48h取片冲洗。使用Gel分析系统对杂交影像进行扫描分析，测定每个杂交信号的强度。1.2.2 SOD1 cDNA在多种人神经组织中的表达(1)逆转录合成SOD1 cDNA：按分子克隆的方法分别得到野生型和突变的SOD1cDNA。(2)hSOD1 cDNA与mSOD1 cDNA的PCR扩增：根据突变的SOD1设计引物，上游引物：5'GTTGCAGTCCTCGGAACC3'，下游引物5'CTTGCATGCTTCCCCA3'

8、;同时根据hSOD1设计引物，上游引物：5'GTTGCAGTCCTCGGAACC3'，下游引物5'CTTGCGGCGATCCCAA3'。扩增条件：94预变性10min，紧随35个循环，每一循环94变性1min，57复性40s，72延伸30s，最后72延伸10min补齐末端。(3)探针标记：方法同1.2.1(2)。(4)Northern blot膜杂交：将同时含有多种人神经组织(小脑、大脑皮层、髓质、脊髓、枕极、额叶、颞叶、壳核)RNA的Northern膜加入65预热的HyB杂交液5ml，排净气泡，封口，65水浴振荡预杂交1h，弃预杂交液(取5ml新鲜的HyB杂交

9、液65预热)，加入变性处理过的纯化探针在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，在适宜的温度下继续温育1624小时。(5)信号检测：方法同前。1.2.3 突变SOD1蛋白质结构的预测分析 运用DNAstar软件对突变后的蛋白质二级结构进行分析;借助Silicon Graphics Inc.O2工作站，运用Insight分子模拟软件对突变后蛋白质的三级结构进行模建分析。2结果2.1 家系成员RNA的Northern 杂交在家系成员5、1、3、20、2中发现了明显异常条带，条带的分子量较其它条带减小(图2)。图2northern 杂交结果，5、20 、1、3 、 2出现异常条带2.2 野生型、突变SO

10、D1 cDNA的PCR扩增我们设计了野生型、突变的SOD1 cDNA的引物，经PCR扩增均得到了特异性产物(图3，4)。2.3 野生型、突变SOD1基因在不同神经组织中的表达检测野生型、突变SOD1基因在人八种不同部位神经组织中的表达，结果野生型、突变SOD1基因在所有组织中均表现阳性杂交信号(图5，6)。比较野生型、突变SOD1基因在不同神经组织中的杂交信号强度(表1)，显示野生型和突变SOD1基因具有相似的组织表达差异性，在大脑皮层的表达最高，其次是髓质，在脊髓的表达最弱。表1野生型、突变SOD1基因在不同神经组织中的杂交信号强度(OD/mm2)小脑大脑皮层髓质脊髓枕极额叶颞叶壳核hSOD

11、1基因4.259.927.952.704.894.844.104.44突变SOD1基因5.378.477.484.786.085.875.405.382.4 突变后SOD1蛋白质二级结构和三级结构预测：根据SOD1全基因翻译序列，2号外显子的插入突变导致翻译时阅读框改变，从而发生移码突变，结果自29号氨基酸残基起发生了改变，至第36号氨基酸残基时遇到终止密码TAA，从而翻译提前终止。图7和8分别为运用DNAstar软件分析所得的野生型和突变后SOD1蛋白质的二级结构。从其二级结构初步分析，野生型SOD1的前35个氨基酸主要形成3个片层和两个转角，在第20-25号氨基酸残基区域有一个较大的亲水区

12、，以第10和第25个氨基酸残基为中心形成两个强抗原区。突变后的SOD1的35个氨基酸残基亦形成3个片层，含有3个转角，在19-34号氨基酸残基区域有一个较大的亲水区，以第11和28号氨基酸残基为中心形成两个强抗原区。说明突变后的SOD1尽管氨基酸数量明显减少，后面7个氨基酸发生了改变，但其二级结构基本上保持了野生型SOD1中对应区域的二级结构，且亲疏水基团及抗原部位亦基本相似。借助Silicon Graphics Inc.O2工作站对野生型和突变型在的三级结构进行模建分析亦发现，在野生型SOD1中，前35个氨基酸残基为带有两个转角的片层结构(图9中绿色部分);突变型SOD1的三级结构与野生型S

13、OD1的相应区域的结构相似(图10)。3讨论3.1 突变SOD1与该家系发病的关系ALS是一种以脑和脊髓中大的运动神经元变性为特征的神经系统变性疾病，其临床特点、疾病进程与这些部位中运动神经元的死亡相平行3，当大脑皮层运动神经元及相关的锥体束受累为主时，患者主要表现为上运动神经元损害的症状和体征，当脊髓前角细胞受累为主时，患者主要表现为下运动神经元损害体征4，5。我们在重庆市发现的这一家系基本符合常染色体显性遗传疾病的家系特点。根据Genebank中报道的SOD1基因的全基因序列，其中2号外显子编码区发生的插入突变将导致mRNA的转录提前终止，使翻译至第36号密码子时遇到终止密码子TAA，从而

14、使SOD1蛋白质翻译提前终止。正常的SOD1蛋白由153个氨基酸组成，而突变后的SOD1蛋白质为35个氨基酸组成的短肽，且29-35位的氨基酸残基由ValLysValTrpGlySerIle变为AspGluGlyValGlyLysHis。这是一种新的SOD1基因突变类型，突变SOD1二级结构基本上保持了野生型SOD1中对应区域的二级结构，且亲疏水基团及抗原部位亦基本相似，提示它们具有相似的理化性质，保持了部分SOD1蛋白的酶活性。但其引起了氨基酸种类和数量上的改变，必然严重影响2号外显子编码的亚单位的生理活性，改变SOD1的整体活性，导致突变SOD1蛋白的抗氧化损伤作用减弱。自由基的产生是神经

15、系统在正常或病理条件下的常见现象。正常脑组织是机体氧化代谢最活跃的器官，且含有大量的极易氧化的不饱和脂肪酸，是最易受自由基侵袭的靶器官，加上脑组织清除自由基的能力较差，对活性氧引起的损伤更加敏感。当体内自由基产生过多或/和机体清除能力降低时，氧化应激产物增多，这些氧自由基可导致各种细胞毒性，氧自由基可造成许多生物分子如蛋白质、核酸、膜多不饱和脂肪酸的损伤，引起超氧化反应，导致细胞结构和功能的广泛性损伤，例如与膜磷脂上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，改变其分子结构，导致粘度增大，流动性变差，从而影响细胞与外界进行物质交换。自由基还使细胞膜、线粒体、轴突受损，影响轴浆运输6，7。我们推测基因突变后S

16、OD1的酶活性可能下降，并导致该ALS家系发病。3.2 SOD1基因在不同神经组织中的表达与家系患者以“下运动神经元损害为主”临床表现的关系Northern杂交是一种RNA水平精确而严谨的检测方法，尤其对在不同组织表达水平有较大差异的基因有很好的相对定量效果。我们构建了mSOD1与hSOD1的cDNA Northern探针，具有稳定性好、不易降解、制备方便等特点，同时由于cDNA Northern探针不包括内含子序列，适用于基因表达的检测。采用同位素标记，可避免抗原抗体反应和酶化学发光反应的影响，使整个过程相对简短，背景较低，结果可信度高。本课题采用含有人多种神经组织mRNA的预制Northe

17、rn对该突变的SOD1 cDNA在不同部位神经组织中表达的情况进行了研究。Northern杂交结果显示野生型和突变SOD1基因具有相似的组织表达差异性，在大脑皮层表达最高，其次是髓质，在脊髓表达最弱。SOD1 mRNA的表达量在一定程度上反映了SOD1的合成水平，表明不同神经组织中SOD1在转录水平和合成水平上的差异。SOD1是有氧生物体内催化超氧化阴离子歧化作用的主要酶类，主要催化：O2-+ O2 + 2H+ H2O2 + O2。对于SOD1基因突变后FALS的发病机制，有研究认为，由于SOD1基因突变后SOD1蛋白的功能丧失，SOD1活性的下降导致了SOD1的抗氧化损伤作用减弱，反应氧浓度

18、升高，从而引起继发性氧化应激损伤8,9。我们发现的这一ALS家系为SOD1的2号外显子编码区的插入突变，导致2号外显子在转录和翻译时阅读框改变，使mRNA的转录提前终止，从而影响SOD1酶的整体活性。使其抑制自由基产生的能力减弱，使生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，造成生物膜结构发生一系列的变化，使之对离子的通透性发生改变，生物酶的活性丧失，线粒体、溶酶体等细胞器发生裂解，DNA氧化损伤加剧，造成神经元的损伤，可能是该家系ALS患者发病的原因。具有抗氧化作用的SOD1基因在不同部位神经组织中的表达存在差异性，在脊髓神经元的表达较其它神经组织弱，与该家系患者以“下运动神经元损害为主，上运

19、动神经元损害轻微”的临床表现之间是否存在关联，需要进一步的试验验证。由于mRNA是细胞合成蛋白质的中间产物，而蛋白质的合成及酶活性表达涉及的因素较多，具体作用机制有待进一步深入探讨。同时由于ALS的发病机制十分复杂，要完全明确ALS运动神经元损害的机制还需要做大量的工作，有必要从蛋白质角度对该家系的发病机制进行进一步深入研究，为ALS甚至其它神经系统疾病的发病机制提供更多的理论依据。【参考文献】 1 史树贵, 廖平, 潘登，等. 肌萎缩侧索硬化一家系报道J. 第三军医大学学报, 2003, 25(3): 273-274.2 史树贵, 李露斯, 陈康宁，等. 一个肌萎缩侧索硬化家系的SOD1基因

20、突变J. 中华医学遗传学杂志, 2004, 21(2): 149-152.3 Beghi E, Mennini T. Basic and clinical research on amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders in Italy: recent findings and achievements from a network of laboratoriesJ. Neurol Sci, 2004, 25(1): 41-60.4 Orrell RW,Marklund SL, deBelleroche JS

21、. Familial ALS is associated with mutations in all exons of SOD1: a novel mutation in exon 3 (Gly72Ser)J. J Neurol Sci, 1997, 153(1): 46-9.5 Cudkowicz ME. Epidemiology of mutation in superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosisJ. Ann Neurol, 1997, 41(2): 210-221.6 Rosen DR, Siddique T, Patterson D, et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene