IgAFc受体介导的中性粒细胞脱颗粒反应的机理研究

1、IgAFc受体介导的中性粒细胞脱颗粒反应的 机理研究3 月第 21 卷第 2期 Chinj 掩哦王 n n es（igaIC）andspecificmonoofonalafibodyweusedto,slJlntl- Jateunodegnmulation.Izctofewinreleasedbysfimulatedneutrophilswasquantitativdydetermined.Re tmltsMoncdonalJ®db0曲andIICcouldbothinducen刚hupllactofewinreleaseHowever,monoelonalanlibodyinduc

2、edrapidandstmttgdegranulafionwhilsttheeffectofgAIC m muchB n k 町.（删 |帅_npatternof rleutID 【IIlildegranulationinducedbyrgAICarmmonoclonalantibodyisdifferentSub.ieetwords Fcreceptor;Neutropfil:DegranttlationIsA通过与细胞表面的IgAFc受体（础）结合 发挥作用.多种髓样细胞，如中性粒细胞，单核细 胞，嗜酸性细胞都表达 FcaR：现在已知FcaR在髓 样细胞中可以介导多种细胞反应，如脱颗粒反应

3、，呼 吸爆发，吞噬反应，细胞因子的释放以及胞内c离子浓度的增加等.它也能够促进ADCC（antibody- dependentcel1.mediatedcy ' tc,toXidty）'据报 道,游离的IsA可以与FcaR结合，但并不引起细胞活 化，只有FcaR在交联X态下，如用单克隆抗体或是 聚合的I,才能引起细胞活化.FR在进行信 号转导时需要靠其他膜蛋白或胞浆内蛋白的协助来 完成.现已知FcaR在跨膜区域有一个带正电荷的 基金项目：国家自然科学基金资助（l和397ff/28;英国 皇家学会访问学者项目资助丰项目部分内容在英国剑桥大学分子免疫病理研究所完成作者单位：1000

4、05北京.中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院毕渡（佳木斯大学医学院研究生）.张伟， 石敏鹿通信作者：张伟【E-mail:zw83423hotmallo_ 皿） 精氨酸，它和FcRT链的带负电荷的天冬氨酸靠静电 吸引形成复合物，并通过7一链进行信号转导.在 FcRT链存在的情况下，交联FcaR引起胞外钙离子的 涌人和胞内酪氢酸磷酸化作用，在没有FcRY链的情 况下，交联FcaR不能引起细胞的活化.本文是我们 对FcaR介导的中性粒细胞脱颗粒反应的研究结果材料和方法主要试剂：胃蛋白酶，FITC交联的抗小鼠IgG,无 钙镁HBSS干粉，无内毒素小牛血清白蛋白，MOPC.2J,细胞

5、松弛素 B均由Sigma公司提供；Percol1分离 液,DextranT500,I由Phannacia公司提供；乳铁蛋 白由Calbiochem公司提供；EGTA由AMRESCO 公司 提供；Iodogen由PierceandWarriner公司提供；兔抗小 鼠IgG,兔抗乳铁蛋白抗体，碱性磷酸酶标记的抗乳 铁蛋白抗体由本室自制：MPSa,可溶性FcaR,I交 联的葡聚糖珠，NIP交联的小牛血清白蛋白(NIP- BSA),抗NIPIsA抗体由英国剑桥大学分子免疫病理和研究所提供，M1P8a腹水经蛋白A柱亲和层析纯 化M1P8a和兔抗小鼠G抗体经胰蛋白酶消化得F(ab),片段末消化的抗体用蛋白

6、A吸附除去.中性粒细胞的分离：健康献血者新鲜外周血，肝 素抗凝在1%的Dexfm】T5o0和5mrUL的EDTA 中混匀.室温静置沉降30min.上清液中的白细胞悬 浮于HBSS中,加在不连续的Pe.0u分离液上(底层 78%Percoll，上层 54%Percol1),400g 离心 30min. 离心后的中性粒细胞层用 HBSS清洗2遍后再悬浮 于HBSS中备用，悬浮液中所含中性粒细胞一般在 95%以上卜lIPSa对中性粒细胞 FmR的结合作用:42+ 个中性粒细胞悬浮在 100id清洗液(PBS,01%叠氮 钠,1%BSA)中，加入不同浓度的 MIP8a,冰浴30 min;清洗3遍后每管

7、加入1001d50倍稀释的FlTC 一抗 小鼠I,再冰浴30min.清洗3遍，用柏01%的 多聚甲醛溶液固定后用流式细胞仪检测.MOPC 21为同型抗体阴性对照Fear对IgA的结合作用：可溶性FcaR用lodo gen法进行Nn标记，标记后的产物过 SephadexG- 25柱除去防I离的 NaI.I标记的可溶性n中加 入501tlIgA葡聚糖珠，室温置旋转混合器混和1h.用2%BSMHBSS清洗3次,在1277型7计数仪 (Phammcia)上对葡聚糖珠进行放射性计数 脱颗粒反应的测定：当lgAIC用于激活中性粒 细胞时.抗NIPI(60tm1)与NIP-BSA先以最适浓 度比在含有 1.

8、5mmollLMgCl 和 lrrmaol/Lcack 的 HBSS中混合,37孵育3h.抗NIPI与NIP-BSA 最适浓度比按文献4所述方法确定.然后在96孔 培养板中将5OI11(3加入lo0的中性粒细胞悬 液(含4MO+个细胞及7.5' ml细胞松弛素 B), 在37' :C反应至预定的时间.当MIPSa用于激活中性 粒细胞时.25i*1MIPSaF(ab)片段与1001的中性粒 细胞悬液混合，室温放置10min,然后每L加入25 兔抗小鼠IF(ab):片段(120,g/m1).37反应至预 定的时问当M n )8a用于封闭中性粒细胞表面 Fo 时,25ulMIPSaF

9、(ab)片段先与100tl的中性粒细胞 悬液混合，室温放置10min,然后每孔加入25 n ltea IC(12m1),37反应至预定的时间.反应完毕，将中性粒细胞上清液与细胞离心分离用双抗体夹心ELISA法检测上清液中乳铁蛋白 的含量.96孔板用兔抗乳铁蛋白抗体包被，碱性磷酸酶标记的抗乳铁蛋白抗体作为第二抗体.由已知m_J.Mardl2001V21.No2浓度的乳铁蛋白绘制标准曲线.实验数据各点均为3个平行孔的平均值加上标准差，每个实验至少重复3次，结果应为实验结果中有代表性的一次.结果1 .M 口 P8a与中性粒细胞膜 Fear的结合:细胞膜 表面有许多蛋白质分子，它们之间相互遮蔽，一般来

10、 说，蛋白质分子仅是部分暴露.M1P8a若能够交联或 封闭中性粒细胞的,F的抗原决定簇必须暴 露出来，这样MIP8a才能够与其结合为此我们采 用了流式细胞技术对其进行了检测与同型抗体阴 性对照MOPE 21相比,MIP8a与中性粒细胞反应后 的荧光强度显着增高，说明W P8a能与细胞膜上FeaR特异性结合(图1).Fluorescenceintensity围1流式细胞仪测定 M n钳对中性粒细胞表面Fear的结合作用Fig1.ettmm-y 口 Ja 岫啤 to XU? tn 蝴 Fear2 .M 口 P8a对FeaR功能的抑制作用：为了能够有 效地封闭中性粒细胞Fear的功能,MIP8a的抗

11、原结合位应位于FeaR用于结合IgA的功能部位将I 标记的可溶性FmR先与tO,交联的葡聚糖珠一起培 养.再将游离的可溶性I FeaR洗掉.对I#交联的 葡聚糖珠进行放射性计数.结果显示放射性强度很 高,说明可溶性Fc已与I交联的葡聚糖珠结合 (图2).若用I标记的可溶性FeaR与未交联有Iga 的葡聚糖珠反应，洗去游离可溶性I F的葡聚糖 珠没有放射性，说明可溶性FeaR对IgA交联的葡聚 糖珠的结合是特异性的.若在I标记的可溶性Fear与IgA交联的葡聚糖珠一起培养时加入MIP8a,洗去游离可溶性受体后葡聚糖珠的每分钟放射性计 数比不加皿P8a时的放射性计数低 95%,说明MIP8a 可以

12、有效地封闭可溶性受体对tO,交联的葡聚糖珠的结合.生 1000 q10030ChinJMicrtiolInu:d,M 眦 h20O1,Vol21,No2 围2M晴h对可溶性Fctr.R与A交联的葡聚糖珠结 合的抑制rig2 BloddngFctr.Rbi.al,etobeadsbyM 嘲 a A:MIPSaB:Negative;C:Positive我们还从另一个角度观察了MIP8a的抗原结合位是否位于%0R用于结合tgA的功能部位.已知 IgAIC可以诱导中性粒细胞脱颗粒反应，这个反应 是由%0R介导的.若MIPSa的抗原结合位位于 FcaR用于结合IgA的功能部位，它应能抑制IgAIC 诱导

13、的中性粒细胞脱颗粒反应为此，我们先用不 同浓度的MIPSaF(ab对中性粒细胞表面 FcaR进 行封闭，再加入IIC观察脱颗粒反应.图3表明， MIPSaF(ab)2浓度为18衅,ml时即可完全抑制lgA Ic介导的脱颗粒反应.可见,MIPSa能特异性结合 F锄并抑制其与IgA结合M1PSaaddedluwell圈3MIPSaF(曲)2对IgAIC介导的脱颗粒反应的抑制 3.1nifibitlanofIC-inducedbreJe 黯 ebyM n 10n,然后再加入兔抗鼠IgG以达到交联FcaR的目 的为了防止中性粒细胞与 MIPSa和兔抗鼠lgG的 n部分结合，通过细胞表面的lgGFc受体

14、介导产生 脱颗粒，我们将IMIPSa和兔抗鼠lgG预先酶解去掉 部分，使反应只可能通过 FcaR介导进行.结果表 明MIPSa交联F可以产生脱颗粒现象，但是与 lgAIC相比，二者引起的脱颗粒反应有着不同的时 间反应曲线(图4).IIC诱导的中性粒细胞脱颗 粒在最初一段时间里反应极其微弱，约30min后乳铁蛋白的释放量缓慢增加，3h后仍未达峰值；而 M1P8aF(ab),交联FeaR介导的中性粒细胞的脱颗 粒反应迅速，在5min内即可有强烈的脱颗粒反应，并在15min乳铁蛋白的释放量接近峰值.f)4080 2016020 ” 1围4IC和nll-a交联Fctr.R介导脱颗粒反应的时 间反应曲线

15、rig4.Timemlofn0phjllacterrlnreleaseinduced byM 聃 aandIc4.钙镁离子对Fc-tR介导的脱颗粒反应的影 响:我们曾经报道lIC诱导的中性粒细胞脱颗粒需要钙镁离子参与，为了观察MIPSa交联FcaR引 起的脱颗粒反应是否也需要钙镁离子参与，我们使用了无钙镁，只有钙没有镁，只有镁投有钙和钙镁同 时存在的4种反应液以分别观察钙镁离子对MIPSa交联FcaR与tgAIC诱导的中性粒细胞脱颗粒反唐 的影响.另外，我们还在反应体系中加入了EDTA或EGTA.EDTA可以络合钙镁两种离子，EGTA只能 络合钙而不能络合镁.结果表明,IIC诱导的中 性粒细胞

16、脱颗粒反应是依赖于钙镁的，只有在钙镁 离子同时存在条件下IgAIC才能介导中性粒细胞的 脱颗粒反应，钙镁任意一种离子单独存在时IgAIC均不能介导中性粒细胞脱颗粒反应.与此结果不 栅.同,_W IP8a交联Fear引起的中性粒细胞的脱颗粒反 应不依赖于镁.在没有镁离子存在的情况下(HBSS 一1mmol/Lc),中性粒细胞释放的乳铁蛋白与钙镁 离子同时存在(rmss-1nanol/Lca2.1.5mraol/LM) 时相当.从对钙离子的需求看，尽管，P8a交联 引起的中性粒细胞脱颗粒反应受到钙离子的影 响，但是并不完全依赖于钙离子.在投有钙离子存 在 flcj(HBSS-1nunoltLCa2

17、1.5nunol/LM 6.66mmolt LEGTA,HBSSqmmol/Lca21.5mraol/L.6.66 mmol/LEDTA,毋 Ss_1.5nunol/L 和无钙镁 HBSS),乳铁蛋白释放的量减少很多，但是不像tsA【C的情况那样反应完全消失(图5)圈5二价离子对Ie,nic和11diP88介导脱颗粒反应的 影响ng5.1lmuU ' nnnaofdlvtmt 麒 tkSrICand 11dIP88mediatedknreleaseAHBSS(EDTA):邺 ss_l 珊 Lc15rtavol/LM-6.66 LEDTA;BHBSS(EGTA):HSS-ImlLc 1.

18、5mFL 史t-666mmollLEGTAc. BssCa,M):雌 lmmLc+15mmL ;D.Hit:6(Ca):ml L;E 口 ss( eNb):HLgS-I.5 眦 LM;FtBss:candMfreetBss5.钙镁离子不影响IgAIC与FouR受体的结 台:IC诱导的脱颗粒反应为什么依赖于钙镁离 子?原因尚不清楚，其中一个可能性是 FcaR结合 Iga的时候需要这些离子参加，对此我们进行了检 测.将Iga交联的葡聚糖珠与I.标记的可溶性 mlIIoI,Mar&20OI,V ol21,No2FeaR在无车镁，只有钙没有镁，只有镁没有钙和钙镁 同时存在的反应液反应.

19、结果表明，在HBSS-lOmmol/LEDTA,HBSS.1.5nunob%M-1nunoi/Lca2,HBSS-1.5nunol/LM 及 HBSS-1nu' nol/Lca2中，【.标记的可溶性FeaR都结合等量IgA交联的葡 聚糖珠，其每分钟放射性计数无明显差异，即IIC与FeaR受体的结合能力并不受钙镁二价离子的影 响（结果未显本）.讨论本文报道了用IIC或单克隆抗体 MIPSa交联中性粒细胞表面FeoR后引起的脱颗粒现象.结果 表明，尽管MIPSa和IIC都可以诱导中性粒细胞 脱颗粒，但二者的作用存在差异IIC诱导的是慢速脱颗粒反应，该反应依赖于钙镁离子，在胞外无 钙离子或无

20、镁离子的情况下，都不能发生反应.而 MIPSa诱导的是快速脱颗粒反应，在胞外无钙离子的 情况下，该反应减弱.但是在胞外无镁离子的情况 下,反应不受影响. 一般认为，受体介导的细胞反应首先需要受体在细胞表面交联，至于用什么样的方法交联并不 重要”人们通常利用单克隆抗体将表面受体交联，用这种方式模仿受体与配体之间的反应 如果这是 正确的，那么无论用MIPSa交联FoolR还是用IgAIC 诱导中性粒细胞反应产生的现象应该一样 ，但是我 们的结果表明，将Fco.R作为受体和FcaR作为配体 产生的现象并不一样.众所周知，钙离子在信号转导中起第二信使的 作用细胞内钙离子浓度升高会引起一系列的反 应,包

21、括呼吸爆发，脱颗粒等等.有两个途径可以使 细胞内钙离子浓度升高，一是细胞外钙离子的涌入， 一是细胞内钙库的释放.在没有细胞外钙离子存在 的情况下,M1PSa诱导的中性粒细胞脱颗粒反应减弱 了很多，说明此种条件下细胞只能动用细胞内钙库 释放的钙来作为第二信使，结果钙离子浓度的升高 较少，使反应减弱.至于钙在IgAIC诱导的脱颗粒 反应中的作用不清楚，可能不仅仅是作为第二信使 否则当反应体系中有镁参加而无钙参加时的现象应 与MtPa相同，即脱颗粒反应仅是减弱，而不是完全 捎失M1PSa交联Fear引起的是快速脱颗粒反应，另外据报道，另一种抗Fear的单克隆抗体My43与中 性粒细胞反应，也可以引起

22、快速强烈的脱颗粒反 应” .IsAIC与MIPSa交联Fear介导的中性粒细 啪栅枷0宣一i - 0_J 兰il 0S2001 年 3 月第 21 卷第 2Mierolh,amol,lareh2001,V21,No.2胞的脱颗粒反应速度不同，推测与单位细胞膜面积上聚集的FcccR的量有关.MIPSaF(ab):为特异性的单克隆抗体，它与Fc亲和力强使膜上聚集的Fedl的密度很高，故可引起快速月颗粒反应；而tgAIc体积较大，使膜上聚集的FeaR的密度较低，故不 能引起快速反应.总之，IC与MIPSa交联FeaR诱导的中性粒细胞脱颗粒反应行为不同.kAIC引起依赖于钙镁离子的慢速脱颗粒反应;MI

23、PSa引起不依赖于镁但是部分依赖于钙快速脱颗粒反应，我们目前正在进一步探索这些反应的机理.参考文棘1sh 肿 LR 唧【for1 肌 Ph4c191mmmolRest1992,11:273,2822Y 朗 mHrLell,Ke n MA0 】凹 n 触 ofyah n 眦 Ianu -T 瑚 帅 e 日 mdesisbybumnPD1 VI l 删咖 uden 1k0cyt 皓 CllnB 甲 Immmol,1987,68:200-2083c 叫 LA,日 mBPs.LejhPcJ.allgA-ds.c 陀 lgA 一叩 niseiSAureusmd1 】n 咖 burst 哪邺 y 鸭 p0

24、lyr n n 叫 ex ColinE 甲 Immmot,1995,101:507?5145AbuGh nz 曰 1RI,F 岫怕 q-,MeckyJ,IgA ireeae,inophill 硼 JImmmol,1989,142:2393 246M 酣帆 HC,v 帆 HjM,vandeWinkelJ 四 Slnletureand 抽【H110f hIFereceptorslRevln LlIl0I,1996,16:423407W n唧【瑚 mb哑哦inn即0Pk山0utrigger andLncreasein n t 丑 releiumbanddegon.BJ,1995.306519523(收祷臼期：1999 11.29) .感染与免疫经血传播