Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡

1、Standard Operation Protocol (SOP)技术方法名称：Hoechst33258荧光染色观察药物诱导细胞凋亡基本原理：Hoechst 33258,也称 bisBenzimide H33258 或 HOE33258分子式为 G5H4MO- 3HCl,分子量为 533.88 , CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258 溶于水，溶解度可达 10mg/ml。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的 蓝色荧光染料， 对细胞的毒性较低。用于细胞核染色时，推荐的 Hoechst 33258工作浓度为 0.5-10以g/ml。Hoechst 33

2、258 为特异性 DNA染料，与A-T键结合，这种染料对死细胞或经70%冷乙醇固定的细胞可立即染色。而活细胞的着色是渐进性的， 在10min内可达饱和。在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散 均匀荧光，由现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致 密的颗粒块状荧光。Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。Hoechst 33258 的最大激发波长为 346nm,最大发射波 长为460nm； Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发 波长为352nm,最大发射波长为 46

3、1nm.试剂与器材1 . Hoechst 33258 贮存液： 称取 Hoechst 33258 试剂1mg，用20ml蒸储水溶解后，滤过， 4C避光保存。用 时蒸储水10倍稀释成染色液。2 .封片液（pH5.5 ） : 20mmol/L 柠檬酸；50mmol/L 磷 酸氢二钠；50%甘油，3 .细胞固定液4%多聚甲醛，现配。操作步骤1.将贴壁细胞以5X105 /ml或其他适宜的密度接种于用 35mmW养皿或其他培养器具中，35mmW养皿每孔1.5- 2ml,37 C、5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁，加入实验药物，继续培养过夜。2 . 4%多聚甲醛固定细胞，4c固定 10-20min3 .去固

4、定液，用PBS洗2遍，每次3分钟，吸尽液体。洗 涤时宜用摇床，或手动晃动数次。PBS清洗后，加Hoechst33258染色液， 室温10min4 .用PBS洗两遍，每次3分钟，超净台中避光风干5 .封片剂封片后（不保存也可不封片），在荧光倒置显微镜下观察并拍照。如为荧光正置显微镜，需将培养皿剪边，较为麻烦，可采用细胞爬片。附注：细胞爬片方法取普通洁净盖玻片于 70叱醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板或 35mMt养皿内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%氤悬浮细胞染色步骤1 .离心收集细

5、胞样品于 1.5ml离心管内，加入 0.5ml固定 液，缓缓悬起细胞，4 c固定10-20min。2 .离心去固定液，用 PBS洗两遍，每次3分钟。洗涤期间 手动晃动。3 .最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。4 .稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。5 .均匀滴上 0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色 5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。6 .用PBS洗两遍，每次3分钟。7 .滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖 玻片，尽量避免气泡。8 .荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350n

6、m左右，发射波长在 460nm左右Hoechst 33258,也称 bisBenzimide H 33258或 HOE 33258。分子式为 G5H4N0- 3HCl,分子量为 533.88, CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞 的毒性较低。Hoechst 33258 染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜 观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色， 或常规的DNAfe色。Hoechst 33258的最大激发波长为346nm 最大发射波长为460nmHoechst 33258和双

7、链DNA吉合后，最大激发波长为352nm最大发射 波长为461nmHoechst 33258 溶于水,溶解度可达10mg/ml。用于细胞核染色时，推荐的 Hoechst 33258工作浓度为0.5-10 g/ml。包装清单：产品编号产品名称包装C1011Hoechst 3325810mg一说明书1份保存条件：-20 C避光保存，一年有效。注意事项：Hoechst 33258 对人体有害，请注意适当防护。荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。抗荧光淬灭封片液 (P0126)可以向碧云天订购。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

8、荧光染料Hoechst 3325喔一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 3325喔一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性 较低。Hoechst染料可透过细胞膜并对 DNA染色而发出强烈的蓝色荧光。它们在聚AT序列的富集区域的小沟处与 DNA结合。Hoechst 33258,也称 bisBenzimide H 33258或 HOE 33258。分子式为C25H24N6O3HCl,分子量为 533.88, CAS Number 23491-45-4。Hoechst 3325提一种可以穿透细胞

9、膜的蓝色荧光染料， 对细胞的 毒性较低。Hoechst 3325琛色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 3325曲常用于普通的细胞核染色，或 常规的DNA染色。Hoechst 33258 染色1 .原理 Hoechst 33258和Hoechst 33342均为非嵌人性荧光染 料。它们在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA吉合。 活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为 DN麻车fo Hoechst 33342和Hoechst 33258 均可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechsr-DNA的激发和

10、发射波长 分别550n标口460nm在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出 亮蓝色荧光。2 .溶液的配制(1)Hoechst 33258 储存液Hoechst 33258lmg0 . 01mol/LPBS(pH 7. 4) 5ml(2)Hoechst 33258工作液(终浓度为 0. 5ug/ml)Hoechst 33258 浓缩液 125ul0 . 01mol/LPBS(pH 7. 4) 50ml3 .操作程序(1)细胞悬液或培养单层细胞等标本，用醋酸一乙醇或Carnoy固定液固定；(2)0. 01mol/LPB疆洗5分钟；(3)Hoechst 33258工作液染色，室温15分

11、钟；(4)0. 01mol/LPB疆洗3次，每次5分钟；(5)用甘油与PBS比伤J为1: 9的混合液或水溶性封片剂封片，荧 光显微镜观察。结果：该染料为DNA勺特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光经固定的凋亡 细胞其染色体荧光 染料的DNA可染性性下降0细胞一经固定就不再是活细 胞，而且细胞固定过程对 细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用 细胞活性”鉴定染料染色 的流式细胞仪检测巫。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为活细胞”和死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 333

12、42能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒 作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧 光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透 性发生改变有关,凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显佳改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结豆发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而 EB、PI_或7-AAD等染料是 不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是 拒染，坯生细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特