豚鼠哮喘模型和哮喘患者气管上皮细胞内皮素1和内皮素转化酶mRNA表达

1、豚鼠哮喘模型和哮喘患者气管上皮细胞内皮素-1和内皮素转化酶mRNA表达 作者：何翔梁永杰汪蜀郭忠良【关键词】 内皮素转换酶 【摘要】 目的 通过逆转录-DNA聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测豚鼠哮喘模型气管上皮内皮素-1（ET-1）mRNA表达，检测哮喘患者气管上皮内皮素-1（ET-1）和内皮素转换酶（ECE）mRNA表达。方法 （1）动物实验部分:Hartley株豚鼠用卵蛋白腹腔注射致敏，雾化吸入激发，提取气管上皮细胞RNA，逆转录将RNA逆转为cDNA，PCR扩增DNA。（2）临床实验部分:设对照组和哮喘组。一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增-actin片段、ET-1片

2、段和ECE片段。PCR产物的鉴定和半定量。计算ET-1/-actin值和ECE/-actin值。结果 （1）动物模型检测:在电泳缓冲液内，紫外灯下可见ET-1为333bp左右条带，与标记DNA条带相对应。（2）临床实验:哮喘组ET-1mRNA表达量明显高于对照组（P<0.05）。哮喘组ECEmRNA表达量与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。结论 RT-PCR技术检测出卵蛋白致敏激发的豚鼠气管上皮细胞ET-1mRNA表达。哮喘患者支气管粘膜ET-1mRNA表达明显增高，而ECEmRNA表达量与对照组比较差异无显著性。关键词 RT-聚合酶链反应 内皮素-1 内皮素

3、转换酶1 / 9【Abstract】 Objective To detect the mRNA expressions of endothelin-1in tracheal epithelium cell from guinea pig asthma model by reverse transcriptional polymerase chain reaction，to detect the mRNA expressions of endotheline-1and endothelin converting enzyme in tracheal epithelium cell from as

4、thma patient.Methods （1）Animal experiment department:sensitize the guinea pig by inject ovi-protein into the abdominal cavity，excitation by aspirate the ovi-protein solutions，extract RNA from tracheal epithelium cell，reverse transcribe the RNA to cDNA，amplify DNA by polymerase chain reaction.（2）Clin

5、ical department:laying the asthema group and the control group，extract RNA from tracheal epithelium cell，reverse transcribe the RNA to cDNA，amplify-actin、ET-1and ECE fragment by polymerase chain reaction.evaluate and semi-quantify the PCR product，calculate ET-1/-actin and ECE/-actin.Results （1）Anima

6、l experiment:we can see the ET-1is about a333bp strap in the electrophoresis solution under the infrared lamp，correspond with the marking strap.（2）Clinical department:The mRNA expressions of endothelin-1of the asthema group is great high than the control group（P<0.05），the difference of mRNA e

7、xpressions of ECE is not significant at two groups（P>0.05）.Conclusion It can detect the mRNA expressions of endothelin-l in tracheal epithelium cell from guinea pig asthma model by reverse transcriptional polymerasechain reaction.The mRNA expressions of endothelin-1of the asthema group is gre

8、at high than the control group，The differece of mRNA expressions of ECE isnot significant at two groups.Key words reverse transcriptional-polymerase reaction endothelin-1 endothelin converting enzyme内皮素-1（ET-1）是至今所发现的最强烈的支气管平滑肌收缩物质之一，并有促进成纤维细胞和平滑肌细胞增殖，以及促进粘膜下腺体分泌的作用 1 。研究发现ET-1参与哮喘的发病和发展 2，3 ，哮喘患者和动

9、物模型的血浆 4 或气管上皮ET-1水平明显增高 5 。研究豚鼠哮喘模型气管上皮细胞ET-1mRNA表达的测定方法有助于进一步阐明支气管哮喘的发病机制，迄今尚未见有关报道。本实验通过逆转录-DNA聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测豚鼠哮喘模型气管上皮ET-1水平 6 ，现报告如下。1 对象与方法1.1 动物实验部分 （1）对象:健康Hartley株豚鼠（复旦大学医学院动物房提供）共16只，体重200250g，雌雄不拘。（2）主要仪器设备和试剂:DNA TRERMAL CYCLER480型自动PCR仪（PERKIN ELMER CETUS），CSD-L型超静台（上海净化设备厂），DY-A型电泳

10、仪（上海生化工程研究所基巴斯公司），BF-300紫外线检测仪（四星公司），ALARM-1000型高速低温离心机（计田公司），37型雾化吸入器（ARI公司），扩增引物、逆转录酶、Taq酶及有关试剂购于上海试剂厂、上海基因公司、上海基康公司。（3）方法:动物模型的建立:用10%卵蛋白溶液按100mg/kg，约0.20.25ml，对豚鼠行腹腔内注射致敏，2周后用1%卵蛋白溶液3ml雾化吸入，每次1min，每天1次共3次，激发豚鼠。提取气管上皮细胞RNA:脱颈椎处死豚鼠，75%乙醇颈部皮肤消毒，剪开并固定皮肤，取出气管，刮净气管外膜，用生理盐水冲洗，置消毒平皿，携入超静台，剪开气管，加Trizol 8

11、 液1ml，用Tip头刮取气管上皮，并吹打至无团块，移入1.5ml EP管中，室温放5min，加0.3ml氯仿，用力晃摇1min，室温放3min，低温离心12000r/min×15min，将无机相移入新EP管中，加0.5ml异丙醇，室温放5min，低温离心12000r/min×20min，去上清液，加1ml75%乙醇洗管，加1ml100%乙醇，放入冰箱-70保存。逆转录将RNA逆转为cDNA:将保存RNA的EP管低温离心10000r/min×10min;去上清液，加20l DEPC水置于冰上，吸取4g RNA液，加DEPC水稀释至12l;加1l Randon Pr

12、ine，置70水浴×10min;加RT mix:Buffer5l、dNTP2.5l、M DTT2.5l、RNase inhibitor1l、M-MLV RTase1l，置40水浴×1h，置95水浴×5min;加GOOD WATER35l至60l:-20保存。（4）聚合酶链反应（PCR）扩增DNA 7 :取cDNA液5l、GOOD WATER35l、Buffer5l、Mgcl 2 2l、引物各1l、dNTP0.5l、Taq酶0.5l;94水浴×2min（94水浴×1min63水浴×2min72水浴×2min，共5个循环）（94

13、水浴×1min60水浴×1min72水浴×1min，共30个循环）72水浴×7min。 1.2 临床实验部分1.2.1 对象 对照组10例，平均年龄（41±9）岁;哮喘组10例，平均年龄（38±7）岁，实验前3个月未应用糖皮质激素治疗。两组均为男性。1.2.2 方法 （1）在电子纤维支气管镜直视下，钳取右中间支气管粘膜活组织35块。（2）根据一步法提取总RNA。（3）逆转录合成cDNA:取总RNA约15g，用逆转录试剂盒（上海基因公司）合成cDNA。（4）PCR扩增cDNA:由上海生化工程公司合成以下引物:肌动蛋白（-actin）:上

14、游:5ATGTGGCACCACACCTTCTACATGAGCTGCG3下游:5CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3用此对引物扩增出838bp的-actin片段。ET-1引物:上游:5AACCATGGATTATTTGTCCATG3下游:5AGTGTTGACCCAAATGATGTCC3用此对引物扩增出230bp的ET-1片段。ECE引物:上游:5AGCGTGAGCGAGGCAGAGAG3，下游:5GGGGTAGAAGATGGTGTTGA3，用此对引物扩增出567bp的ECE片段。PCR反应条件:ET-1:921min422min723min，共35循环。加强延伸:72

15、10min。ECE:941min592min721min，共35循环。加强延伸:727min。（5）PCR产物的鉴定和半定量:反应完成后，取15l PCR反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，可见ET-1为230bp条带、ECE为567bp条带、-actin为838bp条带。在紫外凝胶图像分析仪上进行荧光度测定，计算ET-1/-actin值和ECE/-actin值。1.3 统计学方法 两组实验结果以平均数±标准差表示，组间显著性差异检验采用配对t检验。2 结果2.1 动物模型检测结果 在2%琼脂糖内加入0.5g/ml的溴化乙锭（EB），在加样孔内加入待测DNA与标记DNA，放入电泳仪，在电泳缓冲液内，电压80mV下电泳2030min，放在紫外灯下观察，可见ET-1为333bp左右条带，与标记DNA条带相对应 9 。2.2 临床实验结果 两组均有ET-1和ECEmRNA的表达。哮喘组ET-1mRNA表达量（ET-1/-actin值为0.81±0.04）明显高于对照组（0.11±0.02），P<0.05。哮喘组ECE