复合变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌

1、复合诱变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌第25卷第3期2021年9月青岛大学(工程技术版)JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY(E&T)Vo1.25NO.3Sep.2021文章编号:10069798(2021)03008906复合诱变选育高产3一羟基丁酮枯草芽孢杆菌尹明浩,徐慧.,程殿林,王勇(1.青岛大学生物系,山东青岛266071;2.天津科技大学生物工程学院,天津300457)摘要:选育高产3一羟基丁酮枯草芽孢杆菌,将一株枯草芽孢杆菌YD一1作为出发菌株,通过紫外线,硫酸二乙酯反复诱变处理,选取每一轮发酵3一羟基丁酮产量最高的菌株进入下一轮诱变.结果说明,

2、菌株的复合诱变条件是在照射距离为25cm时紫外诱变30S后再经10%的硫酸二乙酯诱变处理30min,然后进行有利突变株的筛选,通过初筛,复筛和遗传稳定性试验,获得1株遗传性状稳定的3一羟基丁酮高产菌,其产量高达19.02g/L,比诱变前提高了5O.95,其遗传物质经RAPD分析,与出发菌株YD一1相比有较大差异.得到的枯草芽孢杆菌新菌株3一羟基丁酮产量高而残糖量低.关键词:3一羟基丁酮;枯草芽孢杆菌;复合诱变;RAPD中图分类号:Q939.97文献标识码:A3一羟基丁酮具有特有的奶油香味,除了用作奶油,干酪,咖啡的香味增强剂外,还可作为一种重要的化合物来合成多种稀有药物和药物中间体,制造特香型

3、烤烟等.作为一种食用香料,我国GB2760-86已明确规定允许其食用口.目前,3一羟基丁酮的生产方法主要有3种:化学合成法,酶法转化和微生物生产法.化学合成法和酶法转化都是以丁二酮或2,3一丁二醇为原料E,区别在于酶法转化产物得率高,没有其它副产物,但要获得大量特异性的酶比拟困难.丁二酮和2,3一丁二醇本身也是合成香料,而非大宗化工产品,原料来源及价格都受到限制,这是当前限制3一羟基丁酮大规模生产的原因之一.与前二者相比,微生物发酵法具有工艺简单,条件温和,原料来源广泛,价格廉价等优点,是3一羟基丁酮最有潜力的生产方法.但目前有关微生物生产3一羟基丁酮的文献,大多为代谢途径理论方面的研究,少数

4、涉及3一羟基丁酮生产的报道也主要是作为丁二酮和2,3一丁二醇发酵的副产物提及_3.因此,诱变筛选一株高产3一羟基丁酮的菌株具有极其重要的科研意义和现实意义.本实验采用紫外一硫酸二乙酯复合诱变的方法,选育出一株高产3一羟基丁酮的枯草芽孢杆菌.1材料与方法1.1材料,主要试剂及仪器1.1.1出发菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YD一1,本实验室保存.1.1.2主要培养基1)斜面培养基(g/L):酵母粉5;硫酸锰0.1;蛋白胨10;氯化锰1;琼脂20;pH7.0.2)种子培养基(g/I):葡萄糖80;硫酸铵1;酵母粉5;玉米浆10;磷酸氢二钾1;pH7.0.3)发酵培养基(g/L

5、):葡萄糖120;玉米浆10;酵母粉5;硫酸铵l_5;硫酸锰0.05;pH.3试剂收稿日期:20210505作者简介:尹明浩(1984一),男,硕士研究生,研究方向为微生物工程.通讯作者:程殿林,教授.Email:chengdianlin163.eom90青岛大学(工程技术版)第25卷10的硫酸二乙酯(DES):取0.2mL硫酸二乙酯,参加1.8mI无水乙醇,混合均匀;25硫代硫酸钠:硫代硫酸钠25g,用水定容至100mL;缓冲液:0.2MNaHPONaHP,pH7.0;随机引物由上海生物工程公司合成,共2O个引物;TaqDNA聚合酶,dNTPs,RNase购自大连宝生物工程公司

6、;其他常规试剂为国产分析纯.1.2实验方法1.2.1枯草芽孢杆菌发酵工艺取斜面菌种一环,接种于盛有30mL种子培养基的250mL三角瓶中,180r/rain,37摇床培养18h.取2mL培养液转接入另一只盛有30mL发酵培养基的三角瓶中,37摇床培养3d.1_2.2肌酸甲奈酚法测定3一羟基丁酮-在碱性条件下,3一羟基丁酮可与肌酸和甲萘酚生成粉红色复合物,该复合物在530nm处有最大吸收峰.取8支干净比色管分别加人3一羟基丁酮标准溶液和显色剂,6O显色反响15min,721分光光度计530nm测吸光值(OD值),以OD值为纵坐标,3一羟基丁酮含量为横坐标绘制3一羟基丁酮标准曲线,如图1所示.计算

7、公式为T一00224V××10lV式中,丁为3一羟基丁酮含量,g/L;V为样品体积,mL;A涮为吸光度;为稀释倍数.1.2.3复原糖浓度的测定利用DNS法I6测定复原糖含量.1.2.4紫外诱变及菌株筛选将培养6h的菌悬液进行梯度稀释,调整细胞质量浓度为1x1O个/mL,取1OmL置于9cm培养皿中(内置3一羟基丁酮质量仉g图13一羟基丁酮标准曲线一灭菌处理的磁力搅拌针),置于紫外诱变箱的磁力搅拌器上,调整照射距离为25cm,翻开皿盖,分别照射lO,20,3O,4O,5O,6O,7O,8O,90,100s.取不同诱变时间的菌悬液】mL,稀释到比诱变前少一个稀释度,取0.1mL

8、诱变液涂布平板,每个稀释度作三皿平行试验,在37下培养3d.待菌落长出后,计算每皿菌落数,计算诱变后存活细胞浓度,绘制致死曲线.1.2.5DES诱变将培养至对数生长期的菌悬液梯度稀释,调整细胞浓度为1×10个/mL,取5mL置于250mL碘量瓶中,参加pH7.0的磷酸缓冲液5mI,10%的DES0.1mL,于37下震荡培养10,20,30,4O,5O,60min,处理完毕后立即参加1mL25的硫代硫酸钠溶液终止反响,适当稀释后涂布平板,37恒温培养.1.2.6枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取7取培养24h的枯草芽孢杆菌菌悬液1mI,10000r/min离心1min,沉淀以500LTE充

9、分悬浮后加入1OL溶菌酶于37水浴保温30min;加5OL1O的SDS溶液和5L蛋白酶K,充分混匀后置56水浴3h;加等体积的饱和酚,充分混匀,12000r离心10min,抽取上清液加等体积的饱和酚:氯仿(1:1),重复抽提一次;取上清液加1/10体积的3mol/L的醋酸钠(pH5.2)和1LRnaseA充分混匀,37放置2h;12000r离心10rain,弃上清后,参加500L70的乙醇洗涤两次;12000转离心10min,弃上清,置于超净工作台中枯燥,沉淀溶于5OLTE中;将提取的各酵母菌株DNA按紫外吸收法检测0D.和0D.,并计算其浓度.1.2.7RAPD分析以提取各枯草芽孢杆菌菌株D

10、NA为模板,用不同的随机引物分别进行PCR扩增.25L反响体系中参加1O/zgDNA模板,10×PCRBuffer2.5L,25mmol/LMgL,Taq酶5U,2.5mmol/LdNTPs3I,20/mol/L随机引物1L,加ddw至总体积25I,于基因扩增仪中进行扩增反响.反响程序:94预变性4min;94变性1rain,36退火1min,72延伸2rain进行35个循环;再72延伸10min.反响一一/一/4.叶叶格第3期尹明浩,等:复合诱变选育高产3一羟基丁酮枯草芽孢杆菌91结束后,取扩增产物10L于1琼脂糖凝胶中电泳,EB染色30min后紫外灯下观察并拍照记录结果.2结果与

11、讨论2.1绘制生长曲线挑取枯草芽孢杆菌菌株YD一1菌落于装有30mL发酵培养基的250mI三角瓶中,180r/min,37下培养不同时间后,530nm下测定OD值,得到枯草芽孢杆菌生长曲线,如图2所示.可以看出,新接种的枯草芽孢杆菌YD一1在培养的前2h中生长缓慢,37培养2h后进入对数生长期,持续增长直到培养8h后到达稳定期.2.2紫外诱变参考图2所得结果,取培养6h的对数生长期枯草芽孢杆菌YD一1菌悬液5mI,按照1.2.4中所述方法进行诱变处理,致死曲线如图3所示.可以看出,枯草芽孢杆菌菌悬液接受紫外线照射时,致死率变化较为明显,随着处理时间的延长,YD一1的致死率呈不断升高趋势,在处理

12、时间超过40S后,致死率变化趋向平缓,处理60s后致死率已接近100oA.目前倾向于认为在较低的致死率下,正向突变的几率更高9.对于紫外诱变,致死率在7585%之间时诱变剂量相对较低,本实验选择80的致死率,相应诱变时间为30S.诱变菌株经过两轮复筛,从中选取高产菌株,将其命名为M一3O并保存,进行下一步诱变.凸0时间t/h图2枯草芽孢杆菌YD一1生长曲线2.3硫酸二乙酯(DES)诱变2.3.1绘制硫酸二乙酯致死曲线在37摇床中对M一3O用DES处理不同时间后,涂布于琼脂平板,37恒温培养2d后,以平板菌落计数法计算活菌数,绘制DES致死曲线如图4所示.由图可以看出,随着处理时间的延长,菌株的

13、死伤程度增加,其细胞存活率明显下降,经过DES处理2O,3O,40rain后,M一3O的致死率分别为66,85和正交实验确定DES诱变参数蚪旃旃旃诱变时间,/s图3紫外诱变致死曲线0图4DES致死曲线DES诱变的影响因素有诱变温度,DES浓度和处理时间,以此为条件做3因素3水平正交实验,结果如表1和表2所示.由表2中极差分析可以看出,对M一30的DES诱变效果影响因素依次为DES浓度>处理时间>诱变温度.实验结果还说明,A.B.C组为最正确组合.即DES处理条件最优组合为:DES质量浓度为1l7.7g/L,处理时间为30min,处理温度为37.表1D

14、ES诱变枯草芽孢杆菌的因素及水平92青岛大学(工程技术版)第25卷2.3.3复合诱变正突变菌株的选出将活化后的M一3O按上述条件进行诱变处理,即DES质量浓度为1l7.7g/L,在37下,振荡处理30min,速加过量硫代硫酸钠溶液中止反响,吸取诱变后的菌0.1mL涂布于琼脂平板,37恒温培养2d挑菌,进行发酵实验.透过反复筛选,得到3一羟基丁酮产量较高的突变菌株10株,分别命名为s一1s一10,发酵3d后,将摇瓶发酵液补蒸馏水恢复原体积30mL,按照1.2.2所述方法测定其3一羟基丁酮产量,结果如表3所示.表2各因素对DES诱变效果的正交实验实验号诱变温度/lDES质量浓度/(g?L一)123

15、l23123处理时间/3mln123231312羟基丁酮产量/(g?L一)表3各菌株发酵结果分析比拟菌株3一羟基丁酮/(g?L)残糖/菌株3一羟基丁酮/(g?L-1)残糖/YD一112.6O0.87S一518.690.70M一3O15.780.88S一617.210.68S一118.450.46S一718.030.59S一117.220.65S一817.660.41S一318.760.66S一918.780.32S一416.960.76S一1019.O20.45由表3可以看出,经过反复筛选所得到的绝大局部菌株,其3一羟基丁酮产量均有不同程度的提高,其中,S一1O的产量在19.00g/L左右,提

16、高幅度较大(如表4所示)且菌株的残糖量也较低,较之其他枯草芽孢杆菌菌株具有很大的发酵优势,因此,选取该菌株进行遗传稳定性实验.2.4遗传稳定性实验将诱变所得突变株S一1O在斜面上连续传代8次,按照】.2.1中所述方法进行发酵实验,按1.2.2及1.2.3中所述方法测定3一羟基丁酮和残糖,结果如表5所示.由表5可以看出,S10遗传稳定性良好,各代间几乎无差异,在连续传代8次之后,发酵产物中3一羟基丁酮含量仍保持在19.00g/L左右,无太大波动,残糖含量低且稳定,具备作为生产菌株的潜力.2.5RAPD实验结果表4出发菌株与诱变菌株3一羟基丁酮产量比拟表5S一10遗传稳定性实验代数.一.丁量残糖质

17、量分数/2O个随机引物的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳发现,只有5个随机引物扩增产物有条带出现,实验重复3次,结果如图5所示.23456789一I一一R第3期尹明浩,等:复合诱变选育高产3一羟基丁酮枯草芽孢杆菌93图5中,每一随机引物扩增产物左侧为出发菌株YD一1,右侧为S一1O.每条随机引物以YD一1和S一10全基因组DNA为模板经PCR扩增产物中第4条随机引物扩增结果最为显着,这充分说明经化学诱变所得到的S一10与出发菌株相比遗传特性发生了一定改变.3结束语物理诱变,化学诱变是诱变微生物,筛选优良菌株的有效手段.硫酸二乙酯和紫外线作用机理不同,但均可诱导微生物细胞中的DNA发生突变,从而影响微生

18、物的原有性状,使其具有新的特性.笔者采用物理诱变剂紫外线和化学诱4500300020001200800500200图5RAPD实验结果变剂硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌YD一1进行复合诱变.照射距离为25cm,紫外诱变30s后的菌悬液用质量浓度10的硫酸二乙酯诱变处理3Omin,通过初筛,复筛获得了一株3一羟基丁酮高产菌株S一10,产量高达19.02g/L,比诱变前提高了50.95.遗传稳定性实验说明该菌遗传性能稳定,残糖含量较低,同时利用RAPD技术对出发菌株YD一1及S一10进行遗传物质分析,发现两者之间确实存在遗传物质差异,由此得到一株高产3一羟基丁酮且遗传稳定性良好的枯草芽孢杆菌新菌株.对其

19、更深入的研究,尚需进一步工作完成.参考文献:1凌关庭.食品添加剂手册(2版)M.北京:化学工业出版社,1997.2张小舟,曾崇余,任晓乾.乙偶姻合成研究现状及展望J.江苏化工,2001,29(4):2931.3GuptaKG,YadavNK,DhawanS.LaboratoryScaleProductionNofacetoInplusDiacetylbyEnterobacterCloacaeATCC27613J.BiotechnologyandBioengineering,1978,20(12):18951901.4UiS,MasudaH,MurakiH.Laboratory-ScalePnx

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23、n一/in.WANGYong(1.BiologyDepartmentofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China;2?CollegeofBioengineeringTianjinUniversityofScienceandTeehnology,Tianjin300457,China)Abstract:Theaimofthisstudywastobreednewstrainswhichhavehigherproductionofacetoin.WithaBacillussubtilisastheoriginalstrain,andundermutationbyu

24、ltraviolet(UV)anddiethy1suIfate(DES).weusethehighestacetoinproducingStrainofBacillussubtilisineachmutationtreatmenastheorigina1strainnthenextmutation?ThecompoundmutationconditionofYD一1strainwasthatafterthestartingtainwasmutatedbyultravioletfor30satthedistanceof25cm,itwasmutatedby10%diethy1suIfatefor

25、30rain,thentheavailablemutantwasscreenedandaHighacetoin-producingStrainofB口cillsbtiliswithstablegeneticcharacterswasobtainedthroughtheprimaryscreeffing,secondarysereeningandthege-netlestabilityexperiment.Theaeetoinproductionwas19.02g/L,whichwas5O.95higherthanthetartingstrain?Thegeneticsubstancesoftw

26、ostainsweredifferentthroughRAPDanalysis.AnewB口cillussubtiliswithhighacetoinproductionandlowresidualsugarwasobtained.Keywords:acetoin;Bacillussubtilis;compositmutation;RAPD(从第88页转来)StudyontheTemperatureFieldstributionfortheConstantVolumeCombustionBombZHAOYulei,ZHANGJipeng,(CollegeofMechanicalandElectronicEngineering,WANGDechang,HUOWeiQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)Abstract:Basedontheconstan