第二章 基因工程操作常规技术2(方)

1、聚合酶链聚合酶链式式反应反应（polymerase chain reaction, PCR） PCR是模拟体内是模拟体内DNA复制复制条件，应用条件，应用DNA聚合酶反聚合酶反应，特异性扩增某一应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化片段的技术。体外程序化的的DNA合成技术。合成技术。Kary B. Mullis2.1.4 基因扩增技术基因扩增技术PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG533解旋酶解链酶5DNA解旋解链合成引物子链延长5引物酶PCR技术简史D

2、NA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5335DNA解旋解链合成引物子链延长AUCGCGTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGGGAUCG 引物酶 5RNA引物RNA引物TAGCGCTATCGCATCGACGCT GGAUCGAUCGCGPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明DNA解旋解链合成引物子链延长35535335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG ATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶DNA聚合

3、酶DNA聚合酶PCR技术简史 DNA的复制的复制 核酸体外扩增的设想核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明 1971年，年，Khorana提出：经过提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用DNA聚聚合酶延伸引物，并不断重复该过程合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及70年代基因工程技术的发明使克年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了PCR技术简史 DNADNA的复制的复制 核酸体外扩增的

4、设想核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明 1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等人发明等人发明了聚合酶链反应（了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制复制 最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，由于该，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热耐热DNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCR能高效率的进能高效率的进行，随后行，随后PE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR自动自动化热循环仪化热循环仪 19

5、93年，年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖Kary B. Mullis1989年美国年美国Science杂志列杂志列PCR 为十余项重为十余项重大科学发明之首大科学发明之首,比喻比喻1989年为年为PCR爆炸年爆炸年,Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。Mullis开车的时候开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自的两条链，自己的车和对面开来的车象是己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA Mullis的上司有句的上司有句“名言名言”，“我们要扩增我们要扩增这么

6、多这么多DNA样品有什么用样品有什么用”； 到了到了1991，Cetus公司以公司以3亿美元的转让费亿美元的转让费将将PCR相关专利转让给瑞士相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；数亿美元的分红； Mullis于于1993年获得诺贝尔化学奖，年获得诺贝尔化学奖， 三个水浴锅，三个水浴锅， 用手移动用手移动 （Mullis等人当时用的）等人当时用的） 电加热块电加热块 自来水冷却自来水冷却 （PE，1988） 电加热块电加热块 内置循环液冷却内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块三个加热块 机械手机械手

7、 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度温度梯度, 荧光检测荧光检测 (如如 Roche的的Lightcycler) 风加热风加热 Lab-on-chip式的式的PCR仪仪(所谓的芯片所谓的芯片PCR)中国的状况中国的状况 1991年出现三个水浴锅年出现三个水浴锅+机械手的原始机械手的原始PCR仪（华美，复仪（华美，复日等）日等） 现在以半导体（现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日板）制冷式为主（杭州博日,上海上海天呈天呈, 厦门安普利等）厦门安普利等）PCR仪仪72123452

8、2时间（min）94温度（）551 2 3高温变性 低温退火 适温延伸重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性形成单链 DNA变性子链延伸DNA加倍PCRPCR的基本原理的基本原理94模板DNA50引物1DNA引物引物272引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶94第1轮结束第2轮开始50Taq TaqTaqTaq7272第2轮结束PCRPCR体系的主要组分和反应条件体系的主要组分和反应条件标准的标准的PCR反应体系反应体系4种种dNTP混合物混合物各各200umol/L引物引物各各10100pmol模板模板DNA0.12ugTaq DNA聚合酶

9、聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1.5mmol/L1）PCR反应成分反应成分（1）模板）模板单、双链单、双链DNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNA结合蛋结合蛋白类。白类。一般一般100ng DNA模板模板/100 L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。(2) (2) 引物设计：引物设计： a. 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 b. b.引物长度以引物长度以15-40 bp为宜。为宜。 c. c.碱基尽可能随机分布，碱基尽

10、可能随机分布，G+C占占50-60%。 d. d.引物内部避免形成二级结构。引物内部避免形成二级结构。 e. e.两引物间避免有互补序列。两引物间避免有互补序列。f.f.引物引物3端为关键碱基；端为关键碱基；5端无严格限制。端无严格限制。 引物浓度引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩

11、增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量量dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5） Mg2+Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降；产量下降； Mg2+过高过高影响反应特异性。影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可

12、与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度等的浓度影响反应中游离的影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。2）PCR的条件的条件(1) 变性变性使双链使双链DNA解链为单链解链为单链94 20-30s(2) 退火退火温度由引物长度和温度由引物长度和GC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可降低温度可增加反应的灵敏性。增加反应的灵敏性。（3）延伸）延伸70-75，延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数）循环次数主要取决于模版主要取决于模版DNA的浓度的浓度一般为一般为25-35次次次数过多：

13、扩增效率降低次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加错误掺入率增加Reaction Condition for a Typical PCR AssayTypical PCR Thermal Profile*This cycle is normally included in a PCR assay in order toallow any “unfinished” product from previous amplification toachieve its full lengthPCR 动画动画1st cycle2nd cycle3rd cycle过过 程程变变 性性引引 物物 退退 火火D

14、NA 复制复制 灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平2.2. 能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩小时完成扩增增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提活组织等组织的粗提DNADNAPCRPCR的的特点特点PCR的应用的应用 研究研究

15、 基因克隆，基因克隆，DNADNA测序，分析突变测序，分析突变 诊断诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程人类基因组工程 遗传图谱的构建，遗传图谱的构建，DNADNA测序，表达图谱测序，表达图谱 法医法医 犯罪现场标本分析犯罪现场标本分析 肿瘤肿瘤 各种肿瘤检测各种肿瘤检测 其他其他1) 基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNA基因片段基因片段2) 基因检测基因检测内源性病变基因内源性病变基因AA正常人病人人病原微生物基因病原微生物基因正常人正常人 (-)(-)病病 人人 (+)(+)遗传病的诊断遗传病的诊断地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不平

16、衡珠蛋白链合成不平衡HBA1、HBA2第11号染色体上的HBB基因恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）PCR-RFLPPCR-RFLP（限制性核酸片段多态性）法：（限制性核酸片段多态性）法：限制性内切酶限制性内切酶RasRas基因基因突变突变限制性内切酶限制性内切酶正常正常突变突变电电泳泳父父 父父子子母母亲子鉴定亲子鉴定现现 嫌嫌1 1嫌嫌2 2 嫌嫌3 3犯罪现场调查犯罪现场调查1）不对称）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引

17、物物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针制备杂交探针基因组基因组DNA结构功能的研究结构功能的研究PCR的类型的类型限制性引物限制性引物 (低浓度引物低浓度引物)高浓度引物低浓度引物2)反向反向PCR (reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因

18、组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列限制酶限制酶未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重）多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电泳泳引物4）LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒 3病毒4标记引物标记引物 PCR观察观察PCR产物 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 5）锚定）锚定PCRcDNA末端核酸转移酶5CCCC 锚定引物53GGGG3

19、GGGGCCCC3GGGGCCCC5）锚定）锚定PCR6）原位）原位PCRPCR1990年Haase等首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。操作步骤细胞或组织的固定PCR扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物8）RTPCR聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA逆转录酶杂化双链杂化双链PCR扩增RT-PCRRNA template3 5 下游引物cDNA first strand3

20、5 上游引物cDNA first strandcDNA second strand3 5 3 5 反转录酶Taq酶PCRReverse transcription (RT)下游引物上游引物Taq酶 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。9）荧光实时定量）荧光实时定量PCR技术技术荧光探针法（荧光探针法（Taqman技术）技术）9）荧光实时定量）荧光实时定量P