利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因

1、利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因水稻是世界上最重要的粮食作物之一 , 全球有一半以上的人以稻米为主食 , 然而, 虫害却是造成水稻减产的主要原因之一。稻纵卷叶螟 (Cnaphalocrocis medinalis), 俗称卷叶虫 , 刮青虫、苞叶虫等 , 属于鳞翅目 (Lepidoptera) 螟蛾科 (Pyralidae), 是对水稻危害最为严重的主要害虫之一。几丁质合成酶是昆虫体内几丁质合成通路中最后一个酶 ,也是关键酶 ,在昆 虫生长发育中具有重要作用,是控制害虫的理想靶标。RNA干扰(RNA interference,RNAi) 是指在进化过程中高度保守的、由双链RN

2、A(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源 mRNA!效特异性降解的现象。本研究的主要目的是利用体外注射 RNAi和转基因RNAi技术，获得对稻纵卷 叶螟几丁质合成酶基因具有沉默作用的转基因水稻植株 , 从而达到控制稻纵卷叶 螟危害的目的 ,为其的生物防治奠定基础。 取得的主要研究结果如下 :1. 稻纵卷叶 螟几丁质合成酶A基因的克隆及表达谱采用RT-PCR吉合RACE-PC方法从稻纵卷 叶螟中克隆得到几丁质合成酶 A基因(CmCHSA的全长cDNA其长度为5223 bp, 包含 4695 bp 的开放阅读框 , 编码 1564 个氨基酸。生物信息学分析显示该酶有 1

3、6个跨膜螺旋区 ,但无信号肽 ,等电点为 6.63。 同源建模预测显示，CmCHS的三维分子结构中含5个a螺旋,4个B折叠片。氨基酸序列同源性分析表明CmCHS的氨基酸序列与亚洲玉米螟Ostri nia furnacalis 几丁质合成酶A的氨基酸序列一致性最高，高达96%;与甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 、甘蓝夜蛾 Mamestra brassicae 和棉铃虫 Helicoverpa armigera等几丁质合成酶A的序列一致性也较高,分别为92% 92唏口 91%基因时空表达谱分析表明，CmCHS在稻纵卷叶螟整个生长发育时期均有表达,在卵中 的表达量最低,蛹中表达量最高；

4、CmCHS在检测的成虫各个组织中都有表达,其 表达水平高低顺序为：表皮>头部>肌肉>中肠>卵巢>马氏管> 脂肪体 &gt； 精巢。2. 注射dsRN/干扰稻纵卷叶螟几丁质合成酶 A基因的表达以稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因为靶标,设计两个RNAi靶位点并将其命名为CmCHSA-和 CmCHSAP,在体外合成CmCHS的两个dsRNA用显微注射法导入3龄幼虫体内, 然后通过表型观察和荧光定量 PCR(RT-qPCR检测干扰效应。结果表明,注射两种 dsRNA后纵卷叶螟对水稻的取食明显下降,生长发育阻滞,虫体

5、变小变黑和畸形, 有的出现死亡。RT-qPCR表明 ,注射 CmCHSA-和 CmCHSA-两种 dsRNA在 96 h 后,CmCHSA 的表达量相比对照分别下降了 59唏口 64%注射CmCHSA-和CmCHSA-两种 dsRNA 7 d后,稻纵卷叶螟的死亡率分别为 80唏口 83.33%,与对照组相比,分别增 加了 66.67%和 70%;且各组的校正死亡率为 76.92%和 80.77%。3. 重组RNA干扰植物表达载体的构建与鉴定以 CmCHSA-和CmCHSA-两个 片段为靶位点，分别在其两端添加BamH I和Spe I酶切位点并进行人工合成，经 双酶切后与植物表达载体 p1301

6、连接，构建p1301-CmCHSA- *和p1301-CmCHSA- -*重组植物表达载体。PCR双酶切及测序鉴定结果表明重组表达载体 p1301-CmCHSAt*和p1301-CmCHSA-*已构建成功，并采用液氮冻融法将其成 功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。4. 转基因水稻的获得及RNA干扰效应检测用含有p1301-CmCHSA-*和 p1301-CmCHSA-*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号粳稻愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生 , 获得 20株转基因再生植株。靶标位点的 RT-PCR佥测结果表明,6株是含有CmCHSA-*的阳性转基因植株,7株是含有 CmCHSAT的阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照 , 观察发现取食每株转基因水稻 后纵卷叶螟的生命活性明显下降 ,生长发育滞后 , 出现蜕皮受阻 ,虫体变小、畸形 和死亡等情况。用实时荧光定量PCF方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体 内CmCHS基因的mRN表达水平,并统计其死亡情况。结果显示,相较于对照组,取食转入目的基因片段 CmCHSA-*水稻稻纵卷叶 螟CmCHS基因平均相对表达量相下降了 56.8%;取食转入目的基因片段CmCHSA- II *水稻稻纵卷叶螟