去甲基化作用对胃癌细胞生物学行为及xaf1基因表达的影响

1、去甲基化作用对胃癌细胞生物学行为及xaf1基因表达的影响【摘要】 目的：探讨去甲基化药物5脱氧杂氮胞苷(5AzaCdR)对体外培养的胃癌BGC823细胞增殖活性、细胞周期和凋亡以及对此细胞株xaf1基因表达的影响. 方法：用MTT法检测不同浓度5AzaCdR对细胞增殖活性的影响；PI染色和流式细胞仪检测不同浓度5AzaCdR处理72 h后细胞周期分布和细胞凋亡率；RTPCR法检测用药前后xaf1基因表达的变化. 结果：用1×103，5×103，10×103 nmol/L的5AzaCdR处理BGC823细胞6 d后，试验组细胞增殖抑制率较对照组明显升高（P&

2、lt;0.05），并呈剂量依赖关系；流式细胞仪分析表明，各药物浓度处理72 h后凋亡率明显增加：试验组凋亡率分别为（4.53±0.21）%，（8.11±1.01）%和（11.56±0.86）%，与对照组(0.51±0.01)%相比较差异显著(P<0.05). 在5AzaCdR处理前，未检测到BGC823细胞株xaf1 基因mRNA表达，经过5AzaCdR处理后，xaf1 mRNA重新表达. 结论：5AzaCdR可抑制BGC823细胞增殖；促进细胞凋亡；使xaf1基因甲基化状态得到逆转，而重新表达. 【关键词】 5氮2脱氧胞苷；xaf1基因；

3、BGC823肿瘤细胞株；甲基化；细胞增殖；细胞凋亡【Abstract】 AIM: To observe the effects of the demethylating agent, 52 / 20Aza2deoxyctidine (5AzaCdR), on the proliferation, cell cycle, apoptosis and xaf1 mRNA expression of stomach cancer BGC823 cells. METHODS: The proliferation of BGC823 cells treated by different concentr

4、ations of 5AzaCdR was detected by MTT assay. Assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (FCM); the change of xaf1 mRNA expression was semiquantified by RTPCR before and after 5AzaCdR treatment. RESULTS: The growth inhibitory effects on BGC823 cells were observed in a dos

5、edependent manner after exposure to 5AzaCdR at different concentrations (1×103, 5×103, 10×103 nmol/L) for different time. FCM analysis showed that the apoptosis rates in BGC823 cells (4.53±0.21)%, (8.11±1.01)%, (11.56±0.86)% increased significantly after exposure to 5Az

6、aCdR for 72 h as compared with the control group (0.51±0.01)%, P<0.05. No expression of xaf1 gene in BGC823 cells was observed, but it was expressed after 5AzaCdR treatment (5×103, 10×103 nmol/L). CONCLUSION: 5AzaCdR can inhibit the proliferation of BGC823 cells through blockin

7、g cell cycles and inducing cell apoptosis. It can also restore xaf1 gene transcription silenced by demethylation.【Keywords】 5AzaCdR；xaf1；BGC823；methylation；proliferation；apoptosis0 引言 凋亡抑制蛋白因子家族(IAP)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(BIR)结构域1，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP中抑制Caspa

8、se活性最强的成员. XIAP相关因子1(XAF1)是一个新近发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转XIAP对细胞的保护. XAF1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，XAF1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关2. 我们采用5AzaCdR对胃癌细胞株进行处理, 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及治疗的新方法.1 材料和方法1.1 材料 胃癌BGC823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；RPMI1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5AzaCdR（美国Sigma公司）；配制5AzaCdR为

9、1 mol/L的母液，-20保存，使用时用RPMI1640稀释为工作浓度. Tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(BioTek公司)；Trizol(Invitrogen公司)；UV3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(Beckman Coulter公司).1.2 方法1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于RPMI1640培养液中，内含100 mL/L胎牛血清、1×105/L青霉素、100 mgL链霉素和2 mmol/L L谷氨酰胺，置于37 50 mL/L CO2的饱和湿度箱中培养，每34 d消化传代1次. 传代时，常规消化BGC823细胞，置于75

10、 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.1.2.2 MTT法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 L)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCd

11、R药液的完全培养液，每孔100 L，每组设3个复孔；对照组加入等量PBS. 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 L，37孵育4 h后加DMSO 150 L，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔A470 nm值，求其平均值，以A470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线,计算细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR). CPIR()=(1-实验组A470 nm均值对照组A470 nm均值)×100.1.2.3 RTPCR检测xaf1基因mRNA表达 取对数生长期BGC823细胞，药物

12、处理方法同1.2.1. 收集细胞，Trizol一步反向法抽提细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定RNA纯度，A260 nmA280 nm在1.82.0之间. PCR引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56；Sense：5TGGGTGTAGGATTCTCCAGG3，Antisense：5GGTTTGCCCAAGGACTACAA3. 内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52；Sense：5TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3，Antisense：5GTACATGGTATTCACCACCC3，上述引物由大连宝生物有限

13、公司提供合成. 两步法RTPCR： 逆转录反应：20 L反应体系含：2 g模板RNA，0.5 g/L Oligo(dT)18，RNasefree ddH2O，5×Reaction Buffer，2×107 U/L RNase Inhibitor，10 mmol/L dNTP Mix，2×107 U/L AMuLV RT. 70 5 min，37 5 min，37 60 min，70 10 min，4保存. 聚合酶链反应：50 L反应体系含：cDNA 1 L，10×buffer 5 L，25 mmol/L MgCl2 3 L，2.5 mmol/L dNTP

14、 5L，Tap酶0.5 L，上下游引物各1 L，去离子水补至50 L，GAPDH作内参照. PCR仪扩增条件：94变性4 min，按94 30 s，52（或54）40 s，72 45 s，进行35个循环，最后一个循环72延伸5 min. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和GAPDH吸光度比值相对定量.1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为1×109个L，700 mL/L冷乙醇20固定24 h，加RNaseA至终浓度1 g/L，37温育30 min，加

15、碘化丙啶至终浓度50 gL，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测. 统计学处理:实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.2 结果2.1 5AzaCdR对细胞增殖的影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理6 d后，BGC823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的CPIR值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（P<0.

16、05），并且随浓度的增加其抑制的量效关系显著(图1).bP<0.01 vs对照（n=3, x±s）.图1 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后的生长曲线（略）2.2 5AzaCdR对细胞中xaf1基因mRNA表达的影响 5AzaCdR处理前BGC823细胞系的xaf1基因mRNA不表达，在经5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理后，xaf1基因mRNA重新表达，10×103 nmol/L的5AzaCdR处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).2.3 5AzaCdR对细胞周期的影

17、响 BGC823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理72 h后，S期的细胞数量逐渐增加，G2/M期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；24：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h；57：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h.图2 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后GAPDH mRNA的表达（略）M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对

18、照组；24：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；57：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).图3 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后xaf1 mRNA的表达（略）表1 BGC823细胞经5AzaCdR处理72 h后细胞周期的变化（略）aP0.05, bP0.01 vs对照.3 讨论 DNA甲基化是由S腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT

19、)的催化作用下，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5甲基胞嘧啶(5mC)的化学修饰过程3. 近期研究表明，多种人类肿瘤在发展过程中表现异常DNA甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见4. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌5、结肠癌6、黑色素细胞瘤7组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5区域CpG岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的CpG岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×10

20、3，10×103 nmol/L)的特异性DNMT抑制剂5AzaCdR，对体外培养的胃癌BGC823细胞进行干预，RTPCR结果显示在5AzaCdR作用前，xaf1 mRNA不表达，而在5AzaCdR作用后，xaf1 mRNA又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明DNA甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的DNA核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的8. 因此我们通过5AzaCdR人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化治疗肿瘤提供了理论基础. 凋亡在细胞增殖、肿瘤

21、形成和发展中也起调控作用9. 我们应用不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/L)5AzaCdR诱导胃癌BGC823细胞后，MTT结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期分析可见S期的细胞数逐渐增加，G2/M期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于S期，而使得进入G2/M期的细胞减少，由此推断5AzaCdR的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制XIAP对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用2，xaf1

22、也是一种新的干扰素(IFN)诱导基因，其介导了IFN诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡的作用10.【参考文献】 1 Deveraux QL, Reed JC. IAP family proteinssuppressors of apoptosisJ. Genes Dev, 1999, 13(2):239-252.2 Byun DS, Cho K, Ryu BK, et al. Hypermethylation of XIAPassociated Factor 1, a Putative Tumor Suppressor Gene from t

23、he 17p13.2 Locus, in Human Gastric AdenocarcinomasJ.Cancer Res, 2003， 63(4):7068-7075.3 Jones P A, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigeneticsJ. Science, 2001, 293(5532):1068-1070.4 Momparler RL, Bovenzi V. DNA methylation and cancerJ. Cell Physiol, 2000, 183(2):145-154.5 Sakemi R,

24、 Yano H, Ogasawara S, et al. Xlinked inhibitor of apoptosis (XIAP) and XIAPassociated factor1 expressions and their relationship to apoptosis in human hepatocellular carcinoma and noncancerous liver tissuesJ. J Oncol Rep, 2007, 18(1):65-70.6 Chung SK, Lee NG, Rvu BK, et al. Frequent alteration of XAF1 in human colorectal cancers: Implication for tumor cel