医学细胞生物学实验指导

1、 普通生物学实验指导供医学八年制使用华中科技大学生命与技术学院实验教学中心目录实验一 显微镜的结构及使用方法2实验二 动物细胞形态结构的观察5实验三 细胞器的光镜切片观察7实验四 动物细胞培养9实验五 ABO血型鉴定与交叉配血16实验六 血涂片的制作与读片19实验七 细胞有丝分裂标本的制备与形态观察23实验八 蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察27实验九 人外周血染色体制备30实验十 正常人非显带染色体的核型分析32实验一 显微镜的结构及使用方法一、实验目的1. 学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。2. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。3. 了解几种特殊光学显微镜的工作原理及其

2、使用光学显微镜的使用( 一 ) 显微镜的结构及使用方法 光学显微镜，简称光镜 (microscope) ，是生物医学研究及临床工作中常用的仪器，每个学生都必须熟悉它的结构和性能，掌握其使用方法。 1 光学显微镜的主要构造 显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分 ( 图 1-1) 。 (1) 机械部分 镜座：亦称镜脚，是显微镜的基座，用以支持整个显微镜。 镜柱：是镜座向上直立的短柱，用以支持其他部分。 镜臂：是镜柱向上弯曲的部分，适于手握。有些显微镜镜柱与镜臂之间有倾斜关节。 镜筒：连在镜臂前方的镜筒部分，一般长度为16 cm 。有直筒和斜筒两种，前者镜筒上下可调节，后者镜筒是

3、固定的调节器：是装在镜臂上的大小两种螺旋，转动时可使镜台升降或使镜筒上下移动以调节焦距。       粗调节器 ( 粗螺旋 ) 转动时可使镜台或镜筒在垂直方向以较快速度和较大距离进行上下升降，调节物镜与标本的距离。通常在低倍镜下，先用粗调节器找到物像。      细调节器 ( 细螺旋 ) 形状较小，通常在粗调节器的下方或外侧，转动时可使镜台或镜筒缓慢地上下移动，以精细调节焦距，得到清晰的物像。 旋转器 ( 镜头转换器 ) ：装在镜筒的下端，呈盘状，下面有3 4个物镜孔供装置不同放载物台 ( 镜台 ) ：用以放玻片样

4、本，中间有一通光圆孔，称为镜台孔，由此孔可透入集光器传入的光线。 标本移动器：装于载物台上，用于前后左右移动玻片标本。移动器上有标尺，可以测定标本大小。 (2) 照明部分 反光镜 (mirror) ：是一个一面平一面凹的双面镜，装在镜柱基部的前方，可向任意方向转动，其作用是改变光源射出的光线方向，送至聚光镜中心，再经镜台孔照明标本。反光镜的凹面聚光作用较强，通常在光线较弱时使用；在光线强而均匀时，宜用平面镜。 有些显微镜采用电光源代替反光镜，使用时接上电源，在打开电源前，光照亮度旋至最小位置，然后打开电源，旋转亮度旋扭调节光照强度至适宜为止。关闭电源前，应先将光照亮度旋至最小位置。 聚光器 (

5、 又名集光器， condenser) ：位于载物台下方的聚光器架上，由聚光镜和虹彩光阑组成。      聚光镜 由一片或数片透镜组成，其作用相当于一凸透镜，起会聚光线的作用，一般可通过装在镜柱旁的聚光器调节螺旋的转动而上下移动，上升时视野中光亮度增加，下降时光亮度变弱、虹彩光阑 ( 又名光圈， diaphragm) 在聚光镜下方，由十几张活动的金属薄片组成。其外侧伸出一柄，推动此柄可随意调节开孔的大小，以调节光量。 (3) 光学部分 目镜 (ocular) ：位于镜筒上方，常用的有5×，6×，8×，10×，12&#

6、215;，15×，数字越大，放大倍率越高，可根据需要挑选使用。一般装在镜筒上的是10 ×目镜。 物镜 (objective) ：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3 4个物镜。其中最短的刻有“4 ×”或“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜；最长的刻有“100×”符号的为油镜。 在物镜上，还有镜口率 (NA) 的标志。镜口率反映该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。物镜的工作距离是指显微镜处于工作状态 ( 物像调节清楚 ) 时，物镜的下表面与盖玻片 ( 盖玻片的厚度一般为 0.17mm ) 上表面

7、之问的距离。物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如：物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为l00 。 2 光学显微镜的使用方法 (1) 低倍镜的使用方法 检查：用右手握镜臂，从镜箱中将显微镜取出，左手托镜座，平稳地放到实验桌上。使用前应先检查一下显微镜各部分结构是否完整，如发现有缺损或性能不良，要立即报告教师，请求处理。 准备：将显微镜放于自己座位面前实验桌上稍偏左侧，镜台向前镜筒向后，旋转粗调节器使镜台远离物镜，旋转物镜转换器，使低倍镜对准镜台孔，这时可听到转换器边上固定扣碰上而发出的声音，或手上感到一种阻力，

8、说明物镜的光轴已正对镜筒的中心。 对光：打开光圈，将聚光器上升。双眼同时张开，以左眼向目镜内观察 ( 如为双筒显微镜，用双眼观察，下同 ) ，调节反光镜的方向，使光线射入镜筒中，直到求得明亮而均匀的视野为止；或打开电源，调节光照亮度旋钮，直到光亮度最适宜为止。 置片和调整焦距：将玻片标本置于镜台上，注意使有盖玻片的一面朝上，利用标本移动器将玻片夹住，然后将玻片稍加调节，使标本对准镜台孔。从侧面注视低倍镜，转动粗调节器，使镜台慢慢上升，至物镜距标本半厘米处为止，再以左眼自目镜中观察，左手转动粗调节器使镜台徐徐下降，直到视野中出现标本的物像为止；再转动细调节器，使镜台微微上下，调节距离，使物像清晰

9、。 (2) 高倍镜的使用方法 依上法先用低倍镜找到物像后，将欲观察的标本部分移到视野中央。 眼睛从侧面注视物镜，用手转动物镜转换器，使高倍物镜对准标本 ( 如果操作正确，此时物镜与标本之间距离正好，不会碰到 ) 。 眼睛向目镜内看，同时只需轻轻转动细调节器使镜台微微升降，即得到清晰的物像。 (3) 油镜的使用方法 同高倍镜的使用方法 在玻片标本上需要观察的部分加上少许香柏油，然后转动物镜转换器，使油镜对准标本。调节油镜至油镜的前端浸在香柏油内，从目镜观察，同时转动细调节器，至视野出现清楚物像为止。油镜的放大倍数大，观察时要用较强的光线。 观察以后，用粗调节器使镜台下降 ( 镜筒上升 ) ，用擦

10、镜纸将镜头、玻片标本上的香柏油擦去，可用少许二甲苯，但不能用力擦，以免损坏镜头和标本。水分较多的临时制片，使用油镜观察时，应事先吸尽水分。 3 使用光学显微镜的注意事项 (1) 取显微镜时必须右手握镜臂，左手托镜座，平贴胸前。切勿一手斜提，前后摇摆，以防碰撞和零件跌落。 (2) 擦拭显微镜的光学玻璃部分，必须用擦镜纸，切忌用其他硬质纸张或布等擦拭，以免造成镜面划痕。 (3) 切忌用水、酒精或其他药品浸润镜台或镜头。一旦沾染应立即进行处理，以免污染或腐蚀镜头。 (4) 放置玻片标本时，应将有盖玻片的一面向上，否则会压坏标本和物镜。 (5) 观察时应两眼同时张开，用左眼观察，用右眼注视绘图。左手调

11、节粗、细调节器，右手调节标本移动器和绘图。实验完毕后，将显微镜擦拭干净。物镜不要与镜台相对，关闭光圈，适当下降聚光器，将反光镜直立，送回原处。 实验二 动物细胞形态结构的观察一、实验目的观察几种细胞的形态结构二、实验用品显微镜三、实验内容细胞的基本形态观察（一）原理细胞的形态结构与功能相关事很多细胞的共同点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成点。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长型；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一点树枝状突起；游离点血细胞为圆形/椭圆形或圆饼形。不论细胞的形态如何,细胞的结构一般分为三大部分:细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外，如

12、哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。（二）观察方法与结果1.制备猪脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染色为蓝紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁。2.鸡血涂片点制备与观察取一滴鸡血液，靠近一端滴在载玻片上，将另一载玻片点一端呈45°角紧贴在血滴点前缘，均匀用力向前推，使血液在载玻片上形成均匀的薄层，晾干，加瑞氏染液23滴，使覆盖整个血膜，固定0.51min，滴加等量或稍多点新鲜蒸馏水，与染料混匀染色510min，用清水冲去染液，待自然干燥后或用吸水纸吸干，即可进行镜检。显

13、微镜下可见鸡血细胞为椭圆形，有核。白细胞数量少，为圆形。3.观察平滑肌分离装片低倍镜下观察平滑肌分离装片，可见染成紫红色呈纺锤形点肌细胞，细胞核为椭圆形，位于细胞的中央，着色很深，在细胞质中有淡红色的肌原纤维。低倍镜观察 油镜下作业1. 思考题 为什么使用高倍镜或油镜必须从低倍镜到高倍镜或从低倍镜到油镜的顺序进行? 如果高倍镜下找不到物象，应从哪些方面找原因，如何解决?2.绘图截取40×或者油镜100×下鸡红细胞、神经细胞、平滑肌细胞的图。实验三 细胞器的光镜切片观察一、实验目的观察细胞器中光学显微镜下的基本形态结构二、实验内容两种细胞器的光镜切片高尔基复合体的观察脊神经节

14、以硝酸钴固定，再经硝酸银染液浸染制成永久制片。 高尔基复合体能与硝酸银作用，并具有还原能力，使硝酸银呈现棕黑色沉淀颜色反应，因而显示高尔基复合体的形态和位置。 方法： 低倍镜观察：寻找圆形或椭圆形的被染成黄色或淡黄色的细胞； 转换高倍镜：中央透亮区为核所在位置，核周围棕褐色扭曲呈线状、颗粒状结构即为高尔基复合体。 线粒体的观察原理 肝、肾组织细胞富含线粒体，以重铬酸钾固定，再经铁苏木精染色，制成永久制片。 线粒体有双层膜结构，蛋白、磷脂含量很高，有大量羧基和磷酸基等阴离子基团，含阳离子的铁苏木精易与其结合，使线粒体显示兰色反应。 方法低倍镜观察：可见许多被染成深兰色的细胞，选择颜色清晰，密集程

15、度较低的区域； 转换高倍镜：细胞核为1 - 2圆形的不着色的区域（有深兰色的核仁），核周围分布有许多深兰色颗粒或杆状小体，即线粒体。 附：生物学实验绘图方法与要求绘图时生物学实验报告点一种重要形式，其基本要求如下：1.准备好3H铅笔、橡皮、刀、尺子及绘图纸，将绘图纸放在观察物的右边，纸下不要垫书或纸张。2.绘图时，特别注意观察物的形状、各部分点位置、比例和毗邻关系。3.图点位置、大小要适宜，图占报告纸左上方2/3点面积，并考虑注字点位置。4.观察清楚后，选择典型的细胞或者组织，左眼看显微镜，右眼配合左眼，先用铅笔在纸上轻轻描出轮廓，使形态正确，然后再用清晰的线条绘出，线条粗细要均匀不要重复。5

16、.用圆点表示明暗和立体感，点的点大小要均匀，不能涂阴影。6.图绘好后，要在图点右侧注明各部分结构名称，引线要直而平行，长短适度，各引线不能交叉，各线右端上下对齐，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右写。7.每一个图下面要注明图的点名称、放大倍数。8.绘图纸上所有注字（包括姓名、实验日期、题目等）均用铅笔书写，不能用其他笔写。作业.绘图截取40×或者油镜100×下高尔基体和线粒体实验四 动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养。使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命

17、现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离了生物机体后的些变化。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等清洗与灭菌一、实验目的1.了解细胞原代培养、传代培养的基本操作方法；2.掌握细胞培养过程中的无菌操作技术；3.学习倒置显微镜的使用及培养细胞的观察。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步

18、，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0.22m，微孔滤膜(直径90)：孔径为0.22 m，过滤器(直径25)。药品：70或75酒

19、精，0.1新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0.5过氧乙酸，乳酸，37甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水体积分数0.1的焦炭酸二乙酯。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。四、实验步骤(一)清洗1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2.使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液过夜。(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗1015次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。 (5)包装(牛皮纸或一般纸)。

20、(6)高压(15磅20 min)或干热(1702 h)灭菌。(7)贮存备用。 3.胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2NaOH煮沸l0-20 min。 (2)自来水清洗10次。 (3)再用1稀盐酸浸泡30 min。 (4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。（二）消毒1.物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 (2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放

21、人干燥箱内，加热至160，保温90120 min。用于RNA提取实验的用品则需180，保温58 h。 (3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下： 首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。加热高压锅。将放气阀打开，放气510 min，以排除锅内的冷空气。 待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121)30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 )20 mi

22、n。调节火力大小保持该压力。停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。 (4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0.60m、0.45m、0.35 m、0.22 m、0.10m等，以0.22 m除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。

23、在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22m。用布包好，湿热灭菌后使用。 2.化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：(1)70(或75)酒精：超净台里常备70酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。(2)0.1新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1新洁尔灭溶液的容器及纱布。 (3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。 (4)0.5过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。 (5)乳

24、酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭13 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。 (6)37甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。13 d后方可达到消毒空气的目的。 3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事项1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗1015次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗

25、。如没有洗净会影响下一次使用的效果。 2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。. 3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。5.滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时

26、微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。 6.使用化学消毒法时，配制75酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。 六、思考题1.哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么?II、原代细胞培养与观察一、实验目的1.了解细胞原代培养基本操作方法；2.掌握细胞培养过程

27、中的无菌操作技术；3.学习倒置显微镜的使用及培养细胞的观察。二、实验原理动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将它分散成单个细胞后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。2、试剂磷酸盐缓冲液(PBS)、无钙、镁溶液、细胞消化液：0.

28、5胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料乳鼠四、实验方法操作步骤方法一：胰酶消化法1. 洗手，用酒精擦手。2. 点燃酒精灯，将所需用品摆放整齐，方便自己操作。3. 取一只乳鼠，浸入75%乙醇中23s，然后取出来，放在灭菌好的培养皿中。4. 取材：取出无菌的手术器械，如果乳鼠还没有死亡，用镊子夹其头部处死乳鼠。用镊子提起腹部皮肤，用解剖剪充分剪开腹腔，将肝脏组织取下来，放入一个灭菌好的青霉素瓶中，用无菌吸管吸取3mlHanks液清洗23次，直至去掉血污为止。5. 消化：将洗净的组织块移入干净的无菌的青霉素瓶中，将剪刀伸入瓶内反复剪切组织块，直至剪到0.51mm3大小的块状为止。加入2ml0

29、.25%胰蛋白酶，轻轻晃动，去掉胰酶溶液，重新加入3ml胰酶溶液，盖好盖子，放在37水浴中消化2030min，注意每间隔5min振摇一次。视组织块变得疏松，颜色略变白时随即从水浴中取出，放入超净台内，用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞，加入12ml培养液终止胰酶消化，静止片刻，让未被消化完的组织自然沉降，然后用吸管将细胞悬液移入无菌青霉素瓶中，盖好盖子。6. 离心：将青霉素瓶做好标记，平衡后以1000r/min离心8min。在超净台内弃上清，加入3ml培养液，吹打混匀后，取1滴去镜检，适当调整细胞密度。7. 细胞培养：取1ml细胞悬液至一干净的培养皿中，再添加12ml培养液，

30、盖上盖子后，轻轻摇匀，置37培养箱中培养。8. 观察：每天对培养的细胞做常规检查，观察的主要内容是：污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为柠檬黄又显浑浊，表明可能被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。如培养液颜色为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成扁平状）。随着培养时间的延长，细胞生长繁殖数量增加，培养液会逐渐变为黄色，这时可进行传代培养。方法二：14步骤同胰酶消化法5.将洗净的组织块移入消毒的青霉素瓶中，用眼科剪刀剪切成0.5mm的小块，然后加入12滴培养液，轻轻吹打混匀。用吸管分次吸取组织浆块，放

31、入培养瓶壁上散开，然后翻转培养瓶，使贴服组织面朝上，加入34ml培养液，加盖，做标记后，放置一段时间后，待组织小块略干燥能牢固贴于瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶（动作一定要轻，减少振动，防止组织块脱落），使组织块浸泡在培养液中静置培养。6.观察：同胰酶消化法。III.传代细胞培养与观察一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。二、实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐

32、)的混合物，做为消化液。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架

33、、标记笔、解剖板等。2、试剂磷酸盐缓冲液(PBS)无钙、镁溶液细胞消化液：0.5胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料鸡胚细胞四、实验方法在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1.营养液配制:EMEM液                         

34、0;      90%犊牛血清                                10%双抗(1万单位m1)           

35、0;   加至约100单位m1 7.4NaHCO3                    调pH至6.87.0 2.换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。3.消化与分装在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04EDTA1ml十o.5胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留12min后，翻转培养瓶

36、，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之进行分装。4.培养分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37培养。5.观察(1)观察体外培养细胞的几个问题；细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混

37、浊度B.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。D.观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将其分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：A.游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆

38、形，折光率高，此期可延续数小时。B.吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约78h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据

39、细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25以内有新生细胞。一般要观察35个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。十十：细胞占瓶壁有效面积的2575以内具新生细胞。十十十：细胞占瓶壁有效面积的7595具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。十十十十：细胞占瓶壁95以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。D.维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，

40、细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。E.衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。五、思 考 题1.简述细胞原代与传代培养的操作程序及注意事项。3.细胞培养获得成功的关键要素是什么?3.简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。实验五 ABO血型鉴定与交叉配血一、实验原理与目的血型就是红细胞膜上特异抗原的类型。在ABO血型

41、系统中，红细胞膜上抗原分A和B两种抗原，而血清抗体分抗A和抗B两种抗体。A抗原加抗A抗体或B抗原加抗B抗体，则产生凝集现象。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A型血清（含有抗B抗体）与标准B型血清（含有抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞膜上有无A或/和B抗原。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含A、B抗原而分为A、B、AB、O四型。（见下表）ABO血型中的抗原和抗体血 型红细胞膜上所含的抗原血清中所含的抗体O无A和B抗A和抗BAA抗BBB抗AABA和B无抗A和抗B     交叉配血是将受血者的红细胞与血清分别同供血者的血清与红细胞混合，观察有无

42、凝集现象。输血时，一般主要考虑供血者的红细胞不要被受血者的血清所凝集；其次才考虑受血者的红细胞不被供血者的血清所凝集。前者叫交叉配血试验的主侧（也叫直接配血），后者叫交叉配血的次侧（也叫间接配血）。只有主侧和次侧均无凝集，称为“配血相合”，才能进行输血；如果主侧凝集，称为“配血不合”或“配血禁忌”，绝对不能输血；如果主侧不凝集，而次侧凝集，可以认为“基本相合”，但输血要特别谨慎，不宜过快过多，密切注视有无输血反应。本实验的目的是学习ABO血型鉴定的原理、方法以及交叉配血方法。二、实验对象学生三、实验器材和药品1仪器 显微镜，离心机。2器械 采血针，消毒注射器，双凹玻片，小试管，竹签，棉球，腊笔

43、。3药品 标准A血清，标准B血清，生理盐水，75酒精，碘酒。四、实验步骤和观察指标交叉配血示意图（一） ABO血型鉴定1. 玻片法（1） 取双凹玻片一块，用干净纱布轻拭使之洁净，在玻片两端用腊笔标明A及B，并分别各滴入A及B标准血清一滴。（2） 细胞悬液制备 从指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理盐水的小试管内，混匀，即得约5红细胞悬液。采血时应注意先用75酒精消毒指尖或耳垂。（3） 用滴管吸取红细胞悬液，分别各滴一滴于玻片两端的血清上，注意勿使滴管与血清相接触。（4） 竹签两头分别混合，搅匀。（5） 1030min后观察结果。如有凝集反应可见到呈红色点状或小片状凝集块浮起。先用肉眼看有无凝集

44、现象，肉眼不易分辨时，则在低倍显微镜下观察，如有凝集反应，可见红细胞聚集成团。（6） 判断血型 根据被试者红细胞是否被A，B型标准血清所凝集，判断其血型。玻片法鉴定ABO血型2. 试管法（1）取试管2只，分别标明A，B字样，分别加入相应标准血清2滴，各管加入受试者的红细胞悬液12滴摇匀。（2）将上述二试管用1000转/分离心1min。（3）取出小试管，轻弹底部，如沉淀物呈团块状浮起为凝集，呈散在烟雾状上浮进而恢复原混悬状为无凝集。（二） 交叉配血1. 玻片法 （1）用碘酒，75%酒精棉球消毒皮肤后，用消毒干燥注射器抽取受血者及供血者静脉血各2ml，各用一滴制备红细胞悬液，分别标明供血者与受血者

45、。余下血分别注入干净小试管，也标明供血者与受血者，待其凝固后析出血清备用。（2）左两凹玻片左侧标上“主”（即主侧）；右侧标上“次”（即次侧）。主侧滴入供血者红细胞悬液一滴和受血者血清一滴；次则滴入受血者红细胞悬液一滴和供血者血清一滴。 分别用竹签混匀。（3） 1530min后，观察结果。如两侧均无凝集现象，可多量输血；如主侧无凝集而次侧有凝集只可考虑少量输血；如主侧凝集则不能输血。2.试管法取二试管，分别注明“主”、“次”字样，管内所加内容物同玻片法，混匀后1000rpm离心1min，取出观察结果。 注意事项1.所用双凹玻片的试管实验前必须清洗干净，以免出现假凝集现象。2.A及B标准血清绝对不

46、能相混，所用滴管上贴橡皮膏标明A及B、红细胞悬液滴管头不能接触标准血清液面，竹签一端去混匀一侧就不能去接触另一侧。思考题1.在无标准血清情况下已如某人为A或B型，能否用其血去检查未知血型？如何作？2.交叉配血时为何主侧不凝集而次侧凝集时，可以少量输血？还需注意些什么？实验六 血涂片的制作与读片一涂片（一）血液涂片的制作（1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的

47、宽度。（4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。（6）每只动物涂片一张。（7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。（8）置30min1h后较利于观察红细胞的形态。注意事项：如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不是30°而是35°40°左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。如用力过

48、猛白细胞容易破损。二染色血液涂片的染色（1）将待染涂片平放于染色架上。（2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置13分钟。（3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色510分钟（白细胞数多或骨髓标本时间应长一些，如2030min）。（4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。（5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。（6）甩干或晾干玻片。（7）封片。血涂片的观察方法1肉眼观察在观察染色标本时，首先用肉眼对颜色进行观察。如果是正常的末梢血液则呈粉红色，白血病时白细胞高度增加或骨

49、髓瘤的高球蛋白血症等情况下，血涂片会带有蓝色，此时应意识到为异常标本。2高倍镜下观察首先观察血涂片制备和染色是否良好、细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量增减情况。最后对血涂片的体尾交界的区域进行观察，选择细胞分布均匀不重叠、标本不太厚容易观察的地方进行油镜观察。3油镜下观察 边移动视野边观察下列各项：1）染色是否良好：如果血涂片染色确实不好，应重新染色。2）观察红细胞形态：（1）有无人为造成的变形，此外有时载玻片上的碱性物质的溶出（玻璃效应）会导致红细胞呈严重的棘形红细胞。如固定不良（固定液中含有水分时）会导致呈面包圈形红细胞，从而无法观察红细胞的形态。（2）大小如何，是大细胞还是小细胞，

50、有无红细胞大小不一。（3）形态如何，注意有无畸形红细胞、球形红细胞、椭圆新红细胞、靶形红细胞、口形红细胞（唇形红细胞）、中心淡染色红细胞、棘形红细胞、胆状红细胞、皱缩红细胞、泪滴状红细胞、破碎红细胞及镰状红细胞等。（4）是否有染色性的变化，有无嗜多色性红细胞，中心淡染红细胞。（5）红细胞内有无异常。观察是否有嗜碱性点彩、豪-乔小体、卡波环状体红细胞、幼红细胞、帕彭海姆氏小体和疟原虫的出现。（6）有关大小不一，畸形和嗜多色性，可分为轻度±、中度+、高度三个级别。3）观察白细胞形态（1）与红细胞比较，判断白细胞数是否正常，是否增加或减少。红细胞数/白细胞数约为500：1。（2）有关白细胞

51、的种类，要观察大量的白细胞后才可判断是否异常，然后计算白细胞的百分率。在日常检查中，一般只计算100个，但是发现异常或白细胞有增加时，尽量增加到200个。计算的白细胞数越多，白细胞百分率的可信度越高。4）观察血小板形态（1）通过与红细胞的比较，判断血小板数量是否正常，是增加或减少。正常情况下每1520个红细胞中有1个血小板。（2）注意大小的变化。（3）观察未加抗凝剂而直接从毛细血管采集的标本时，要注意血小板的凝集性（观察由若干血小板凝集的现象。如果呈散在状，则怀疑为血小板无力症）。（4）观察有无寄生虫，当白细胞减低或白细胞分类中单核细胞增多时，应注意观察红细胞内有无疟原虫。 各种典型血细胞的照

52、片（油镜下）1血小板 2红细胞 3正常白细胞 实验结果1数码拍照（1）依次在低倍（×10）、高倍（×40）、油镜（×100）下观察红细胞、白细胞以及血小板正常与异常的变化。（2）用数码相机拍摄不同倍数下的细胞照片。（3）输入电脑，比较分析各组间的差异。红细胞呈桔红色，白细胞核紫色，嗜酸颗粒细胞鲜红色，嗜碱颗粒细胞蓝紫色，中性颗粒细胞紫或紫红色，淋巴细胞及单核细胞浆蓝灰色，血小板紫色。2注意事项：1染色涂片水冲洗后，应在空气中自然干燥或风干，不可用火烤干。2染液量要充足，勿使染液蒸发干燥。3细胞染色过浅或过深，待标本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色数秒或数分钟。

53、4保存过久的细胞涂片，细胞染色会退色，可重新染色。5新鲜涂片应立即染色。作业绘图：红细胞及各种白细胞。实验七 细胞有丝分裂标本的制备与形态观察一、实验目的通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂、有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程。二、实验用品 1、材料和标本 洋葱根尖压片。 2、器材和仪器 显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。 3、试剂 70乙醇、改良碱性品红染液。三、实验内容 细胞分裂对生物的个体发育和生存，对种族绵延有着十分重要的意义，高等生物体内细胞的分裂方式有三种：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。 一、动物细胞无丝分裂的观察一蛙血涂片 (一)

54、原理 无丝分裂不仅是原核生物增殖的方式，而且雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中也发现此现象，因为此过程没有出现纺锤丝和染色体的变化，故称无丝分裂(Ami tosis)。其后无丝分裂又在各种动植物中陆续发现，尤其在分裂旺盛的细胞中更多见，但遗传物质平均分配否?及其分裂的机制尚不十分清楚。 蛙红细胞体积较大、数多，而且有核，是观察无丝分裂的较好材料。 (二)观察与结果 在高倍镜下，可见到处于不同阶段分裂过程中的蛙红细胞，核仁先行分裂，向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后，从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞；子细胞较成

55、熟的红细胞小。 二、细胞有丝分裂的观察一马蛔虫子宫切片、洋葱根尖压片 (一)原理 细胞有丝分裂(Mitosis)的现象是分别由弗勒明(Flemming，1882)在动物细胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化，染包体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个子细胞的过程。 马蛔虫受精卵细胞中只有6条染色体，而洋葱体细胞的染色体为16条，因为它们都具有染色体数目少的特点，所以便于观察和分析。 (二)观察 1动物细胞有丝分裂的观察马蛔虫子宫切片取马蛔虫的子宫切片标本，先在低倍镜下观察，可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞，它们均处

56、在不同的细胞时相。每个卵细胞都包在卵壳之中，卵壳与卵细胞之间的腔，叫卵壳腔。细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化，并转换高倍镜仔细观察。马蛔虫受精卵的有丝分裂间期(Interphase) 细胞质内有两个近圆形的细胞核，一为雌原核，另一为雄原核。两个原核形态相似不易分辨，核内染色质分布比较均匀，核膜、核仁清楚，细胞核附近可见中心粒存在。 分裂期(Mitosis) 前期(Prophase)雌、雄原核相互趋近,染色质逐渐浓缩变粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色体相互混合，两个中心粒分别向细胞两极移动，纺锤体开始形成。 中期(Metaphase)

57、染色体聚集排列在细胞的中央形成赤道板，由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观的两种不同现象，侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，中心体之间的纺锤丝与染色体着丝点相连；极面观由于染色体平排于赤道面上，六条染色体清晰可数，此时的染色体已纵裂为二，但尚未分离。洋葱根尖细胞有丝分裂 后期(Anaphase)纺锤丝变短，纵裂后的染色体被分离为两组，分别移向细胞两极，细胞膜开始凹陷。 末期(Telophase)移向两极的染色体恢复染色质状态，核膜、核仁重新出现，最后细胞膜横缢，两个子细胞形成。 2植物细胞有丝分裂的观察洋葱根尖切片将洋葱根尖切片标本先在低倍镜下观察，寻找生长区，这部分的细胞分裂旺盛，大多处于分裂状态，细胞形状呈方形。换高倍镜仔细观察不同分裂时期的细胞形态特征与动物细胞有丝分裂特征比较，找出植物细胞有丝分裂的特点和两者的区别。3. 制备蚕豆根尖临时压片水解：取出根尖放在1N HCl中60水解8min，蒸馏水水洗3次。 染色