qPCR引物设计

1、qPCRqPCR引物设计引物设计Novobio Proprietary & Confidential应用类型应用类型 绝对定量（Absolute Quantification） 相对定量（Relative Quantification） microRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷贝数变异（CNV Research） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）1. Primer 1. Primer blast blast 引物引物设计及特异性设计及特异性检验工具检验工具Novobio Proprietary & Confidentialhttp

2、://tools/primer-blast/整合了Primer3软件，再加上Blast进行引物特异性的验证Primer blastPrimer blastNovobio Proprietary & Confidential输入基因号输入基因号或或FASTA序列序列定义引物的范围定义引物的范围（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围，则可填入Forward 1 to 1000, Reverse 1050 to 3000若有已知引物，可填入，以测试特异性针对sybr qPCR：产物大小填100 to 200（最大不超过300）可用默认

3、值（最佳Tm为60度，波动范围57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）Primer blastPrimer blastNovobio Proprietary & Confidential引物是否需跨不同引物是否需跨不同Exon选择1 - 无所谓选择2 - 必须跨不同Exon选择3 - 可以不跨Exon勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron（当以基因组（当以基因组DNA为模板时）为模板时）基因组基因组DNADNA干扰的判别干扰的判别Novobio Proprietary & ConfidentialNo gDNA det

4、ected in the RT control (flat green/red line)Detection of contaminating gDNA in theRT control (dark blue line)no gDNA removal+RTRTNo templatecontrol+RTRT防止基因组防止基因组DNADNA污染的污染的两种引物设计方法两种引物设计方法Novobio Proprietary & ConfidentialAPrimer spans an intron/exon boundaryBPrimer flank an intronPrimer blas

5、tPrimer blastNovobio Proprietary & Confidential勾选时表示要检测引勾选时表示要检测引物的特异性物的特异性填入要比较的物种填入要比较的物种（可输入通用名，如human/mouse/rat/rabbit当需要同时比较多物种时，点击”Add more organisms”勾选勾选”show results in a new window”-点击点击”Get Primers”Primer Primer blast blast 结果结果Novobio Proprietary & Confidential基因的基因的Exon位置位置引物的位置引

6、物的位置Primer blast Primer blast 结果结果Novobio Proprietary & Confidential引物的基本情况引物和非相关产物的配对情况2. 2. qPqPCRCR引物的网络数据库引物的网络数据库Novobio Proprietary & ConfidentialPrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR).

7、 PrimerBank contains over 306,800 primers covering most known human and mouse genes./primerbank/PrimerBankPrimerBank 结果结果Novobio Proprietary & Confidential有些引物是附带了验证结果的Novobio Proprietary & ConfidentialmiRNART primerStep 1:Stem-loop RTStep 2:Real-time PCRcDNAForward

8、primerReverseprimerFQTaqMan probe成分：成分：1. 茎环茎环RT引物引物2. 正向引物正向引物3. 反向引物（通用）反向引物（通用）4. TaqMan探针（可选）探针（可选）3. miRNA qPCR的引物设计（茎的引物设计（茎环引物环引物法）法）Novobio Proprietary & ConfidentialmiRNA miRNA qPCRqPCR引物数据库引物数据库数据库来源：MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，http:/www.ncbi.nlm.

9、/pmc/articles/PMC1351374/Novobio Proprietary & Confidential以以has-miR-16为例：为例：成熟miRNA序列（末端8个碱基用下划线标注）has-miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG1）RT引物（注：5端为通用的Stem和 Loop序列，末位8个碱基和miRNA末端序列互补）CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA2）Forward primer（注：下划线标记的部分和免去末端6个碱基的靶miRNA序列同源）ACACTCCAGCTGGGTAG

10、CAGCACGTAAATA3）Reverse primer（注：序列固定）TGGTGTCGTGGAGTCG4）Taqman MGB探针（下划线标记部分与miRNA末端序列互补）(6-FAM) TTC AGT TGAG CGCC AATA(MGB)miRNA qPCR的引物设计的引物设计Novobio Proprietary & Confidential内参U6（Human/Mouse/Rat）的引物CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT注：U6不属于miRNAmiRNA qPCR的的内参引物内参引物附录附录1 1 - - 染料染料法引物的设计法引物的

11、设计原则原则Novobio Proprietary & Confidential（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2）、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物 自身形成环状发卡结构；（3）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子；（4）、引物之间的TM相差避免超过2；（5）、典型的引物18到24个核苷长；（6）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于 300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同（7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其 特异性附录附录2 - 2 - Ta

12、qmanTaqman探针及引物的设计原则探针及引物的设计原则Novobio Proprietary & Confidential（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子；（3）、引物TM值为60左右，探针的TM值为70左右（确保探针先于引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10左右）；（4）、探针的5端应避免使用鸟嘌呤G，因为5G会有淬灭作用，而且即使 是被切割下来还会存在淬灭作用； （5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应 效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；

13、 （6）、引物之间的TM相差避免超过2；（7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；（8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；（9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其 特异性 附录附录3 - 3 - TaqmanTaqman探针合成探针合成时注意事项时注意事项Novobio Proprietary & Confidential（1）引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特

14、异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证；（3）确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失；（4）探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95，2min; 95，20s，60，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。附录附录4 - 4 - 逆转逆转录方法的选择录方法的选择Novobio Proprietary & Confide

15、ntial逆转录方式逆转录方式 1-step (one tube) RT-PCR1-step (one tube) RT-PCR（病毒检测） cDNA合成与PCR同管进行 快速、更少污染 对于稍微有些降解的RNA检测灵敏度更高 2-step RT-PCR2-step RT-PCR（基因水平变化） 一次cDNA可用于多次PCR附录附录5 5 - - RTRT引物的选用引物的选用 GSP：常用于一步法RTPCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；不适用于降解的RNA 随机引物：适

16、合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。2-step Real-time 2-step Real-time RT-PCRRT-PCR的逆转的逆转录引物选择录引物选择Novobio Proprietary & ConfidentialAmplicon 3-end: 2 kb(N)9 Oligo-dT+(N)9Oligo-dTAmplicon 3-end: 6 kbOligo-dT Oligo-dT+(N)9(N)9(A)n使用Oligo-dT作为引物：扩增离3端远近不同的片段，离3越远扩增越差必须使用Oligo-dT+(N)9附录附录6 6 qPCRqPCR引物的验证结果示意引物的验证结果