RNA提取定量与RT-PCR

1、第一部分第一部分 细胞总细胞总RNARNA的提取及定量的提取及定量 所有RNA的提取过程中都有五个关键点：1.样品细胞或组织的有效破碎；2.有效地使核蛋白复合体变性；3.对内源RNA酶的有效抑制；4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 p1010-5-5g RNA/g RNA/细胞细胞 pRNARNA分离的方法分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍- -有机溶有机溶剂法；氯化锂剂法；氯化锂- -尿素法；蛋白酶尿素法；蛋白酶K-K-细胞质细胞质RNARNA提取法；提取法；异硫氰酸胍异硫氰酸胍-

2、 -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法( (TrizolTrizol法法) )等。等。p目前常用的是目前常用的是TrizolTrizol法。法。pTrizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂p其主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。p酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。p在加入氯仿离心后，氯仿比重大，使溶液分为水相、中间层和有机相。RNA在上层水相中，DNA和蛋白质位于中间层，有颜色的下层为

3、有机相。p取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。pRNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。p严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 p最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。1.焦碳酸二乙酯（DEPC) 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2.异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使

4、RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离出来，又对出来，又对RNARNA酶有强烈的变性作用。酶有强烈的变性作用。 3.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 4.其他 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。 2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O

5、2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 4.配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 样品处理样品处理p提取组织提取组织RNARNA时，每时，每5050100mg100mg组织用组织用1ml 1ml TrizolTrizol试剂对组织进行裂试剂对组织进行裂解；解；p悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 5-10 1010

6、6 6个细胞加个细胞加1ml 1ml TrizolTrizol后，反复后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。p培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用TrizolTrizol进行消化、裂解，进行消化、裂解，TrizolTrizol体积按体积按10cm10cm2 2/ml/ml比例加入。比例加入。 ( (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNARNA的前提；细胞数量与的前提；细胞数量与TrizolTrizol的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。) )实验材料实验材料：人胚胎肾细胞：人胚胎肾细胞

7、293293 1.细胞或组织加Trizol（RNAisoPlus）后剧烈振荡15s，室温放置5min，使其充分裂解。 （注意：此时可放入-70长期保持）2.按0.2ml 氯仿/1ml Trizol加入氯仿(本实验加100l)，剧烈振荡混匀后室温放置5min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)3.4 12,000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60。4.吸取上层水相，至另一离心管中。一般400-450l 就足够了，宁少勿多！ （注：千万不要吸取中间界面）5.加入等体积

8、异丙醇混匀，4放置5-10min。 6.4 12,000g离心10min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。 8.4 12,000g离心5min，尽量弃上清。 9.室温晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）10.加入10l无RNase的水，充分震荡混匀。收集适量细胞，加500l Trizol用移液枪反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀向裂解液中加100 l氯仿4, 12000g 离心15min吸取上清液200250 l 至另一新

9、离心管中(切忌吸出白色中间层)向上清中加入等体积等体积异丙醇混匀4, 12000g 离心10min缓慢沿离心管壁加入500l 75%乙醇4, 12000g 离心5min小心尽量弃去乙醇加入10l RNase-free水溶解沉淀备用室温静置5min盖紧离心管盖，用手振荡15s室温静置5min上下颠倒离心管充分混匀室温静置10min小心弃去上清室温干燥沉淀2-5min（1 1）（2 2）（3 3）（4 4）（5 5）（6 6）（7 7）（8 8）（9 9）洗涤离心管壁轻轻上下颠倒原原 理：理：1.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2.而且物质对光的吸收是具有选择性的3.各种不同的物质都具有其各

10、自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.pRNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约 40g/ml 的单链RNA。用双蒸水稀释RNA样品（1lRNA+49l水）倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:dsDNA(双链DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/mlpRNA纯品:OD260 /OD280 2.0(1.82.0)，OD260

11、/OD230 2.0 p若OD260/OD280小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。p若OD260/OD280大于2.0，则提示可能有异硫氰酸残存或RNA降解。pOD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。pRNARNA得率低：得率低： A. A.样品裂解或匀浆处理不彻底。样品裂解或匀浆处理不彻底。 B.RNA B.RNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。pA260/A2801.65 A260/A2801.65 ： A.RNA A.RNA应使用应使用TE BufferTE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定。稀释后再进行吸光度

12、值的测定。 低离子浓度和低低离子浓度和低pHpH值条件下值条件下A280A280值偏高。值偏高。 B. B.样品匀浆时加的试剂量太少。样品匀浆时加的试剂量太少。 C. C.匀浆样品时未在室温放置匀浆样品时未在室温放置5 5分钟。分钟。 D. D.吸取水相时混入了有机相。吸取水相时混入了有机相。 E.RNA E.RNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。pRNARNA降解降解 A. A.组织取出后没有马上处理或冷冻。组织取出后没有马上处理或冷冻。 B. B.待提取待提取RNARNA的样品没有保存于的样品没有保存于-60-60至至-70-70，而保存在了，而保存在了-5-5至至-20-20。 C. C

13、.细胞在用胰酶处理时过度。细胞在用胰酶处理时过度。 D. D.溶液或离心管未经溶液或离心管未经RNaseRNase去除处理。去除处理。 E. E.电泳时使用的甲醛电泳时使用的甲醛pHpH值低于了值低于了3.5 3.5 。pDNADNA污染污染 A. A.样品匀浆时加的试剂量太少样品匀浆时加的试剂量太少 B. B.样品中含有有机溶剂样品中含有有机溶剂( (如乙醇，如乙醇，DMSODMSO等等) )，强缓冲液或碱性溶液，强缓冲液或碱性溶液第二部分第二部分 逆转录逆转录- -聚合酶链反应聚合酶链反应 以其中的mRNA作为模板分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

14、1.鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。 2.禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4.MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的

15、RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。（一）反转录酶的选择（一）反转录酶的选择按下列组分配制按下列组分配制RTRT反应液反应液l l l l l 反转录反应条件如下反转录反应条件如下第一链第一链cDNAcDNA2 2 l lPerfectShotPerfectShot TaqTaq 1010 l l上游引物上游引物 (10 (10 M)M)1 1 l l下游引物下游引物 (10 (10 M)M)1 1 l lRNaseRNase Free H2O Free H2O总体积总体积6 6 l l2020 l l取取0.2 ml PCR0.2

16、 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂( (注注意每换一种试剂换一个新吸头意每换一种试剂换一个新吸头) )： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCRPCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，反应液集中于管底，将反应管放到基因扩增仪将反应管放到基因扩增仪(PCR(PCR仪仪) )上上 .PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性30s， 60退火30s， 72 延伸45s。如

17、此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 温度9494变性变性（30s30s）55 55 退火退火（30s30s）72 72 延伸延伸（30s30s）循环1循环2 循环3 p琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度孔径的大小决定于琼脂糖的浓度pDNADNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. .pDNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与

18、分子筛效应。不同的DNADNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带的区带( (迁移速度与分子量的对数值成反比关系迁移速度与分子量的对数值成反比关系).).1.1.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。迁移率比溴酚蓝慢。 2.2.染料：染料：GelviewGelview、EBEB3.3.电泳缓冲液：电泳缓冲液：TB

19、ETBE4.4.琼脂糖琼脂糖5.5.DNA Marker 5000DNA Marker 5000倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于6060，否则温度太高会使制板变形，否则温度太高会使制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔电泳前，确认样品孔位于电场负极；电泳前，确认样品孔位于电场负极；点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多GelviewGelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔有毒，切勿用手接触，更不要污

20、染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久紫外线照射不要太久PCR常见问题o无扩增产物o非特异性扩增或拖尾o假阳性问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品样品A 样品样品B 正对照正对照1.1.纯度：含有抑制物纯度：含有抑制物2.2.浓度：含量低浓度：含量低3.3.质量：全长质量：全长4.4.结构：二级结构结构：二级结构 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用优质纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板试剂盒提取模板DNADNA2.2.加大模板的用量加大模板的用量3.3.用好的反转录酶用好的反转录酶4.4.用温度高的反转录酶用温度高的反转录酶无扩增产物之模板原因1.引物引物错误错误2.引物设计不好引物设计不好3.引物降解引物降解4.引物合成、纯化不好引物合成、纯化不好 原原因因对对策策1.1.合成前检查合成前检查2.2.评价、重新设计引物评价、重新设计引物3.